Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.
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Artigo de método
Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo primário desta pesquisa foi desenvolver uma abordagem confiável e eficiente para isolar armadilhas extracelulares (NETs) de neutrófilos da medula óssea de ratos. Esse esforço surgiu devido às limitações associadas ao método tradicional de extração de TNEs do sangue periférico, principalmente devido à escassez de neutrófilos disponíveis para isolamento. O estudo revelou duas metodologias distintas para a obtenção de neutrófilos de rato a partir da medula óssea: um procedimento simplificado de uma etapa que produziu níveis de purificação satisfatórios e um processo de duas etapas mais demorado que exibiu maior eficiência de purificação. É importante ressaltar que ambas as técnicas produziram uma quantidade substancial de neutrófilos viáveis, variando entre 50 a 100 milhões por rato. Essa eficiência refletiu os resultados obtidos com o isolamento de neutrófilos de fontes humanas e murinas. Significativamente, neutrófilos derivados da medula óssea de ratos exibiram habilidades comparáveis para secretar NETs quando comparados com neutrófilos obtidos de sangue periférico. No entanto, o método baseado na medula óssea produziu consistentemente quantidades notavelmente maiores de neutrófilos e NETs. Esta abordagem demonstrou o potencial de obter quantidades significativamente maiores desses componentes celulares para futuras aplicações a jusante. Notavelmente, esses NETs isolados e neutrófilos são promissores para uma variedade de aplicações, abrangendo os domínios da inflamação, infecção e doenças autoimunes.
Introdução
Os neutrófilos constituem um subconjunto crítico de leucócitos que desempenham um papel fundamental na resposta imune inata. Caracterizam-se por núcleos multilobados e grânulos contendo várias proteases e peptídeos antimicrobianos1. Os neutrófilos funcionam principalmente através da degranulação, fagocitose e formação de NETs. A observação dos TNEs foi feita pela primeira vez por Takei e col. em 1996, durante um experimento em que neutrófilos foram estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA)2. Posteriormente, o processo de formação da NET foi denominado "NETosis" por Brinkmann et al.3 em ....
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Protocolo
O estudo foi realizado sob uma licença de projeto (No. 20211404A) concedida pelo Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University, em conformidade com as diretrizes do Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University para o cuidado e uso de animais. De acordo com as diretrizes éticas, os ratos utilizados neste estudo foram mantidos em ambiente controlado com ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura de 22-24 °C e umidade de 50%-60%. Os ratos tiveram acesso a ração e água ad libitum. Os animais utilizados neste estudo foram ratos machos Sprague Dawley (SD) com 6-8 semanas de idade, pesando cerca de 250 g e livres de patógenos específicos....
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Resultados
O protocolo aqui descrito delineia dois métodos distintos, cada um caracterizado por purificação melhorada ou etapas simplificadas. Ambos os métodos produziram aproximadamente 0,5 x 108-1 x 108 neutrófilos por rato. A análise por citometria de fluxo, empregando o kit de detecção de apoptose da anexina V-FITC/PI, exibiu viabilidade celular acima de 90%, comparável às de camundongos e humanos (Figura 1). Enquanto a contaminação linfocitária parecia inevitável durante o is.......
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Discussão
O isolamento de neutrófilos constitui uma etapa fundamental no estudo da NETosis, onde a seleção de um método de isolamento apropriado é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis. Um fator importante a pesar é a ocorrência de contaminação linfocitária durante o isolamento. Enfrentar esse desafio é particularmente significativo ao isolar neutrófilos de rato da medula óssea. Apesar da distinta faixa de densidade de neutrófilos (1,0814-1,0919, com pico em 1,0919) em relação aos linfócitos (1,0337-1,0765, com pico.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nos. 82004154, 81900311, 82100336 e 81970345).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| A488-conjugado burro anti-coelho IgG(H + L) | Invitrogen, EUA | A32790 | |
| A594-conjugado burro anti-rato IgG(H + L) | Invitrogen, EUA | A32744 | |
| A594-conjugado cabra anti-rato IgG1 | Invitrogen, EUA | A21125 | |
| Mieloperoxidase anti-rato | Abcam, Inglaterra | ab134132 | |
| Elastase de neutrófilos anti-rato | Abcam, Inglaterra | ab21595 | |
| Citômetro de imagem Celigo | Nexelom, EUA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, EUA | 10104159001 | |
| soro fetal bovino (FBS) | Gibco, EUA | 10099141C | |
| Hank ' s Solução salina balanceada (HBSS) | Gibco, EUA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, EUA | 33342 | |
| Isoflurano | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, EUA | 81381 | |
| Soro de burro normal | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldeído | biosharp, China | BL539A | |
| Penicilina-estreptomicina | Hyclone, EUA | SV30010 | |
| Percoll | GE, EUA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma, EUA& | nbsp; P1585 | |
| Kit de ensaio Picogreen dsDNA | Invitrogen, EUA | P11496 | |
| Kit de isolamento de neutrófilos de rato | Solarbio, China | P9200 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mídia | Hyclone, EUA | SH30809.01B | |
| RWD Máquina Universal de Anestesia Animal | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) ratos | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, EUA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, alemão | 1139ML100 |
Referências
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.
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Reimpressões e permissões
