Summary

Puntura modificata della vena della coda e della vena del pene per il prelievo di sangue nel modello di ratto

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per offrire alternative di raccolta del sangue rapide, facili e affidabili per il modello di ratto. Descriviamo tre diversi metodi di prelievo del sangue in base al contesto: puntura della vena della coda in anestesia o su un animale cosciente e puntura della vena del pene dorsale in anestesia.

Abstract

I campioni di sangue sono richiesti nella maggior parte dei progetti di animali sperimentali per valutare vari parametri ematologici. Questo documento presenta due procedure per la raccolta del sangue nei ratti: la puntura della vena laterale della coda e la puntura della vena del pene dorsale, che offrono vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche precedentemente descritte. Questo studio mostra che queste due procedure consentono un campionamento rapido (meno di 10 minuti) e producono volumi di sangue sufficienti per la maggior parte dei test (202 μL ± 67,7 μL). La puntura della vena dorsale del pene deve essere eseguita in anestesia, mentre la puntura della vena laterale della coda può essere eseguita su un animale cosciente e trattenuto.

L’alternanza di queste due tecniche, quindi, consente il prelievo di sangue in qualsiasi situazione. Mentre è sempre consigliabile che un operatore sia assistito durante una procedura per garantire il benessere degli animali, queste tecniche richiedono un solo operatore, a differenza della maggior parte dei metodi di prelievo del sangue che ne richiedono due. Inoltre, mentre questi metodi precedentemente descritti (ad esempio, bastone giugulare, prelievo di sangue della vena succlavia) richiedono un ampio addestramento preliminare per evitare danni o morte dell’animale, la puntura della vena caudale e della vena dorsale del pene sono raramente fatali. Per tutti questi motivi, e a seconda del contesto (ad esempio, per studi che includono ratti maschi, durante il periodo perioperatorio o immediatamente postoperatorio, per animali con sottili vene della coda), entrambe le tecniche possono essere utilizzate alternativamente per consentire ripetuti prelievi di sangue.

Introduction

Il prelievo di sangue è necessario per la maggior parte degli studi sugli animali, sia in vivo che in vitro. Nei ratti, poiché la frequenza e la quantità di prelievo di sangue possono essere significative, è utile avere diverse alternative per la raccolta. Vari metodi sono stati descritti in studi precedenti.

Le tecniche più comunemente usate sono la puntura della vena caudale e il prelievo di sangue della vena safena. Il campionamento delle vene della coda è adatto a tutti i ceppi di ratto. Con un addestramento adeguato, la procedura è semplice da eseguire e causa un disagio minimo all’animale1. Allo stesso modo, il prelievo di sangue della vena safena, a condizione che sia fatto correttamente, è anche un metodo di raccolta rapido e semplice. Nessuno dei due metodi richiede l’anestesia ed entrambi consentono prelievi ripetuti di piccole quantità di sangue. Tuttavia, la puntura della vena safena di solito produce un volume di sangue inferiore1 e richiede la presenza di due persone per lasciare un arto posteriore esposto per la puntura2.

Se è necessario raccogliere grandi quantità di sangue da un singolo animale, è possibile utilizzare la puntura cardiaca o la puntura della vena cava (fino a 10 ml di sangue possono essere prelevati da un ratto da 150 g con puntura cardiaca2). Queste tecniche richiedono l’anestesia e sono procedure terminali. L’animale deve essere eutanasia dopo una di queste due tecniche2. Il bastone giugulare è un’alternativa che può essere utilizzata se è necessario raccogliere grandi quantità di sangue in uno studio che non ha ancora raggiunto il suo endpoint. Tuttavia, questa tecnica richiede anche notevoli abilità tecniche per evitare danni all’animale; Pertanto, il suo uso dovrebbe essere limitato3.

Altre tecniche, come il prelievo di sangue della vena succlavia, non richiedono l’uso di anestetici prima della raccolta del sangue e consentono il campionamento ripetuto di piccoli volumi di sangue. Tuttavia, per questa tecnica sono necessarie una manipolazione moderata e un’appropriata incisione dell’ago. Un’operazione impropria può causare dolore animale o addirittura mortalità, e l’addestramento per questo metodo può essere meticoloso4.

Altre procedure aneddotiche includono la puntura orbitale e la puntura della vena sublinguale, entrambe le quali richiedono un anestetico, e non sono raccomandate né ampiamente utilizzate. Sebbene studi precedenti abbiano dimostrato una raccolta di sangue più rapida mediante puntura orbitale rispetto alla puntura della vena caudale, è stato riscontrato che la puntura orbitale in anestesia dietil-etere era meno ben tollerata rispetto a quest’ultimo metodo (basato sui punteggi di eccitazione degli animali e sulla produzione di urina)5. Inoltre, questo metodo è fortemente influenzato dall’abilità della persona che esegue la procedura e viene eseguito principalmente da veterinari esperti. Comparabilmente, la puntura venosa sublinguale è meno angosciante ed è raccomandata per il prelievo di sangue ripetuto6. Tuttavia, questa tecnica presenta gravi effetti avversi come una ridotta assunzione di cibo e acqua, che può portare alla morte dell’animale7.

Questo studio descrive due metodi utilizzati nel nostro laboratorio per il prelievo di sangue ripetuto. La puntura della vena della coda può essere eseguita su un animale cosciente e il danno tissutale e gli effetti avversi sono minimi. La modifica di questa tecnica in questo studio include la stabilizzazione della coda con l’indice e il medio, che consente a un singolo operatore di eseguire la raccolta del sangue. La puntura della vena del pene dorsale è già stata descritta per semplici iniezioni endovenose. Questa tecnica viene eseguita in anestesia e consente una fonte di sangue affidabile in caso di difficoltà con altri metodi (ad esempio, durante l’immediato periodo postoperatorio, con un piccolo animale, quando si esegue il prelievo di sangue perioperatorio in anestesia). Analogamente al campionamento delle vene caudali, la lesione nel sito di puntura avrà un effetto complessivo minore sull’animale rispetto alle tecniche sopra menzionate8. Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di offrire ai ricercatori inesperti alternative di campionamento del sangue semplici e affidabili in base al contesto (ad esempio, per procedure eseguite in anestesia, per studi che includono ratti maschi, per animali con vene caudali sottili).

Protocol

Le procedure sono state eseguite su ratti Lewis maschi di 3 mesi, ciascuno del peso di 300-400 g. Sono stati inclusi un totale di 24 animali, con tre condizioni di puntura: 12 ratti sono stati sottoposti a puntura della vena caudale senza anestesia (gruppo TV senza anestesia) e altri 12 ratti sono stati anestetizzati per sottoporsi sia alla puntura della vena caudale (gruppo TV con anestesia) che alla puntura della vena del pene (gruppo PV con anestesia). Tutte le procedure sono state approvate e hanno rispettato le line…

Representative Results

Il successo è stato definito come un prelievo di sangue che produce almeno 100 μL di sangue in meno di 10 minuti (dal tempo di puntura alla fine della raccolta del sangue), e il fallimento è stato definito come un prelievo di sangue che produce meno di 100 μL di sangue o impiega più di 10 minuti per recuperare il volume di sangue richiesto. Era consentito un massimo di 250 μL di sangue per campione. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un test ANOVA unidirezionale per confronti multipli e il test …

Discussion

La puntura della vena della coda è un metodo efficace per ottenere sangue da un ratto cosciente. Tuttavia, quando un animale è sotto anestesia, l’effetto dell’isoflurano può portare a spasmi vascolari e rendere inadatta la puntura della vena della coda11. Come dimostrato in questo studio, un’alternativa in questa situazione è quella di raccogliere il sangue dalla vena del pene, che ha più successo e produce un volume significativamente maggiore di sangue in meno tempo. È importante ricordare…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da Shriners Children’s Boston (B. E. U., K.U., C.L.C.). L.C. è finanziato da “La Bourse des Gueules Cassées”, “La Bourse Année Recherche” e “La Bourse de l’Amicale des Anciens Internes des Hôpitaux de Paris”. Y.B. è finanziato da “La Bourse des Gueules Cassées”. Y.B. e I.F.v.R. sono finanziati dagli Shriners Hospitals for Children (l’ID delle borse di studio è rispettivamente #84308-BOS-22 #84302-BOS-21). Questo materiale è parzialmente basato sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation sotto Grant No. CEE 1941543. Il sostegno parziale del National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01EB028782, R56AI171958 e R01DK114506) è riconosciuto con gratitudine. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Materials

0.5 mL | 28 G ½  Insulin Syringes BD 329424 for tail vein puncture
0.5 mL | 30 G x 5/16 Insulin Syringes BD 320468 for penile vein puncture
250 L  Microtainer blood collection tubes with K2EDTA BD 365974
Gauze Sponges Curity 6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine E-Z Systems EZ-190F for penile vein puncture
Isoflurane, USP Patterson Veterinary 1403-704-06 for penile vein puncture
Nosecone for Anesthesia World Precision Instruments EZ-112 for penile vein puncture
Rodent Restraint Cone Harvard Apparatus ST2 52-95-86 for tail vein puncture
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable) Peco Services Ltd 69023
Webcol Alcohol prep pads Simply Medical 5110

Referências

  1. Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
  2. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
  3. Luzzi, M., et al. Collecting blood from rodents: A discussion by the Laboratory Animal Refinement and Enrichment Forum. Animal Technology and Welfare. 4 (2), 99-102 (2005).
  4. Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
  5. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: Comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory Animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  6. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
  7. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
  8. Nightingale, C. H., Mouravieff, M. Reliable and simple method of intravenous injection into the laboratory rat. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 860-861 (1973).
  9. Blood collection: The rat. IACUC Guideline. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/guidelines%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022)
  10. Staszyk, C., Bohnet, W., Gasse, H., Hackbarth, H. Blood vessels of the rat tail: A histological re-examination with respect to blood vessel puncture methods. Laboratory Animals. 37 (2), 121-125 (2003).
  11. Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), e21-e31 (2011).
  12. Hernaningsih, Y., Akualing, J. S. The effects of hemolysis on plasma prothrombin time and activated partial thromboplastin time tests using photo-optical method. Medicina. 96 (38), 7976 (2017).
  13. Powles-Glover, N., Kirk, S., Jardine, L., Clubb, S., Stewart, J. Assessment of haematological and clinical pathology effects of blood microsampling in suckling and weaned juvenile rats. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69 (3), 425-433 (2014).
check_url/pt/65513?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Charlès, L., Agius, T., Filz von Reiterdank, I., Hagedorn, J., Berkane, Y., Lancia, H. H., Uygun, B. E., Uygun, K., Cetrulo Jr., C. L., Randolph, M. A., Lellouch, A. G. Modified Tail Vein and Penile Vein Puncture for Blood Sampling in the Rat Model. J. Vis. Exp. (196), e65513, doi:10.3791/65513 (2023).

View Video