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Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

DOI:

10.3791/65515

⸱

September 22nd, 2023

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In This Article

Summary

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Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Abstract

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O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.

Introduction

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Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem....

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Protocol

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1. Preparação das soluções

  1. Preparação de solução precursora de polidimetilsiloxano (PDMS)
    1. Preparar a solução precursora negativa de PDMS (também usada para a solução de precursor de cola). Coloque o elastômero em um barco de pesagem usando uma espátula e pese-o. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:10. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
      NOTA: Esta solução precursora de PDMS é despejada na placa de micropoço piramidal quadrada de 6 poços para formar o molde negativo. Esta é a mesma solução que é usada para a solução precursora de col....

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Results

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Plataformas de triagem de fármacos baseadas em esferoides para estudar os efeitos quimioterápicos são cada vez mais procuradas devido à ênfase na modulação do microambiente tumoral sobre o encapsulamento esferoide em biomateriais replicantes de tecido nativo. Aqui desenvolvemos um método para preparação de esferoides tumorais multicelulares e posterior encapsulamento e imageamento em hidrogel 3D. Os esferoides são preparados em moldes de micropoços (Figura 3A,B), que resultam em esferoides c.......

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Discussion

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Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rendimento. Os.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
70% de etanolFisher Scientific LC22210-4
15 mL CônicosFALCON352097
Placa de 24 Poços Ultra Placas de Fixação Ultra BaixaFisher Scientific07-200-602
Placa de Petri de 35 mmAmazon706011
Poli(etilenoglicol)-acrilato de 4 braços (4 braços PEG-Ac; 10 kDa)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL CônicasFisher Scinetific
AggreWell 400 de 6 poçosStemCell Technologies, Vancouver, Canadá34421Micropoços piramidais quadrados 
solução de enxágue antiaderenteStemCell Technologies, Vancouver, CanadáCat #: 07010
Ácido aspártico-arginina-cisteína-glicina-valina-prolina-metionina-serina-metionina-arginina-glicina-cisteína-arginina- ácido aspártico (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptídeoGenic Bio, Xangai, Chinan / aSíntese personalizada
Capa de fumaça químicaKEWAUNEE99151
Matriz de Membrana de Porão Corning Matrigel, LDEV Grátis Detergentematriz de membrana de porãoCorning 356234
- Triton-XSigma AldrichT8787Surfactante não iônico
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher Scientific BP231-100
Pipetas descartáveis (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Fisher Scinetific1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL (FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Soro Fetal BovinoHyCloneSH30073-03
Solução de Formaldeído 37%Sigma AldrichF1635
SlumpysGBS4100SFSL
Pipetas de Transferência de VidroFisher Scinetific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glicina-Arginina-Cisteína-Ácido Aspártico-Arginina-Glicina-Ácido Aspártico-Serina (GRCD-RGDS) peptídeoGenic Bio, Shanghai, Chinan/a
HemacitômetroBright-Line383684
Solução hidrofóbica - Repel Silano Incubadora GE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
NUAIRENU-8500
Microscópio Invertido (Axiovert 25)Zeiss663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)Fisher Scientific D1125
Leica Confocal SP8Leica Microsystems Inc.
Microscópio de Luz e Fluorescente (Axiovert 200M)Zeiss3820005619
Micro tubos de centrífugaFisher Scientific2 mL: Software de Microscópio 02681258
ZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594 Santa Cruz Biotechnologysc-23927
ParafilmPARAFILM PM992
PBS (1x), pH 7,4HyCloneSH30256,01
Penicilina EstreptomicinaMP Biomedicals1670046
Pipeta AidDrummond Scientific Co.P-76864
Pontas de Pipeta (1– 200 µ L, 101– 1000 µ L)Pipetasde 2707509
PlásticoFisher Scientific Fisher Scientific13-711-9D
Barcos de Pesagem de Plástico (100 mL)Amazon mdo-azoc-1030
poli(etilenoglicol)-ditiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)Laysan BioSH-PEG-SH-3400-5g
Polidimesiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Slygard 182]Elsworth Adhesives3097358-1004Pó de Polidimetilsiloxano
Quest92897
Iodeto de propídio, 1 mg/mL soln aquoso. Fisher Scientific 
RPMI-1640 Médio (1x)HyCloneSH30027-02
Espaçadores de silicone - Folha de silicone, 0,5 mm de espessura/13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488 Capuz de Cultura de Tecidos Santa Cruz Biotechnologysc-365823
NUAIRENU-425-600
Trietanolamina, ≥ 99,0% (GC) Sigma Aldrich90279
U-87 MG células de glioblastoma humanoAmerican Type Culture Collection HTB-14
3181345107 para Placas de Vidro de síntese personalizada de Transferência Descartáveis Padrão Luvas de Exame Livres de AAJ66584AB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  2. Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.

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Tumor SpheroidsPEG HydrogelsSpheroid EncapsulationGlioblastoma ModelSpheroid Matrix InteractionsMicrowell MoldsConfocal MicroscopyHydrogel StainingCell Viability AssessmentStem Cell Markers

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