Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.
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Artigo de método
Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz
Neste artigo
Resumo
Resumo
O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.
Introdução
Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem....
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Protocolo
1. Preparação das soluções
- Preparação de solução precursora de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Preparar a solução precursora negativa de PDMS (também usada para a solução de precursor de cola). Coloque o elastômero em um barco de pesagem usando uma espátula e pese-o. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:10. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
NOTA: Esta solução precursora de PDMS é despejada na placa de micropoço piramidal quadrada de 6 poços para formar o molde negativo. Esta é a mesma solução que é usada para a solução precursora de col....
- Preparar a solução precursora negativa de PDMS (também usada para a solução de precursor de cola). Coloque o elastômero em um barco de pesagem usando uma espátula e pese-o. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:10. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
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Resultados
Plataformas de triagem de fármacos baseadas em esferoides para estudar os efeitos quimioterápicos são cada vez mais procuradas devido à ênfase na modulação do microambiente tumoral sobre o encapsulamento esferoide em biomateriais replicantes de tecido nativo. Aqui desenvolvemos um método para preparação de esferoides tumorais multicelulares e posterior encapsulamento e imageamento em hidrogel 3D. Os esferoides são preparados em moldes de micropoços (Figura 3A,B), que resultam em esferoides c.......
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Discussão
Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rendimento. Os.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 70% de etanol | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
| 15 mL Cônicos | FALCON | 352097 | |
| Placa de 24 Poços Ultra Placas de Fixação Ultra Baixa | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Placa de Petri de 35 mm | Amazon | 706011 | |
| Poli(etilenoglicol)-acrilato de 4 braços (4 braços PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Cônicas | Fisher Scinetific | ||
| AggreWell 400 de 6 poços | StemCell Technologies, Vancouver, Canadá | 34421 | Micropoços piramidais quadrados |
| solução de enxágue antiaderente | StemCell Technologies, Vancouver, Canadá | Cat #: 07010 | |
| Ácido aspártico-arginina-cisteína-glicina-valina-prolina-metionina-serina-metionina-arginina-glicina-cisteína-arginina- ácido aspártico (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptídeo | Genic Bio, Xangai, China | n / a | Síntese personalizada |
| Capa de fumaça química | KEWAUNEE | 99151 | |
| Matriz de Membrana de Porão Corning Matrigel, LDEV Grátis | Detergente | matriz de membrana de porão | Corning 356234 |
| - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Surfactante não iônico |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Pipetas descartáveis (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL (FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Soro Fetal Bovino | HyClone | SH30073-03 | |
| Solução de Formaldeído 37% | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Slumpys | GBS4100SFSL | ||
| Pipetas de Transferência de Vidro | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Glicina-Arginina-Cisteína-Ácido Aspártico-Arginina-Glicina-Ácido Aspártico-Serina (GRCD-RGDS) peptídeo | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | |
| Hemacitômetro | Bright-Line | 383684 | |
| Solução hidrofóbica - Repel Silano | Incubadora GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| NUAIRE | NU-8500 | ||
| Microscópio Invertido (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific | D1125 | |
| Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Microscópio de Luz e Fluorescente (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Micro tubos de centrífuga | Fisher Scientific | 2 mL: Software de Microscópio 02681258 | |
| Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | ||
| Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7,4 | HyClone | SH30256,01 | |
| Penicilina Estreptomicina | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipeta Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Pontas de Pipeta (1– 200 µ L, 101– 1000 µ L) | Pipetas | de 2707509 | |
| Plástico | Fisher Scientific Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Barcos de Pesagem de Plástico (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| poli(etilenoglicol)-ditiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| Polidimesiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Slygard 182] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Pó de Polidimetilsiloxano |
| Quest | 92897 | ||
| Iodeto de propídio, 1 mg/mL soln aquoso. | Fisher Scientific | ||
| RPMI-1640 Médio (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Espaçadores de silicone - Folha de silicone, 0,5 mm de espessura/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Capuz de Cultura de Tecidos Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| NUAIRE | NU-425-600 | ||
| Trietanolamina, ≥ 99,0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG células de glioblastoma humano | American Type Culture Collection | HTB-14 |
Referências
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
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Reimpressões e permissões
