Venös trombosanalys i en musmodell av cancer
Summary
Denna artikel syftar till att presentera en optimerad metod för att bedöma venös trombos i en muscancermodell, med hjälp av vaskulära klämmor för att uppnå venös ligering. Optimering minimerar variabiliteten i trombosrelaterade mätningar och ökar relevansen för human cancerassocierad venös trombos.
Abstract
Denna metodartikel belyser de kirurgiska nyanserna av en gnagarmodell av venös trombos, särskilt i samband med cancerassocierad trombos (CAT). Djup ventrombos är en vanlig komplikation hos canceröverlevare och kan vara potentiellt dödlig. De nuvarande murina venösa trombosmodellerna involverar vanligtvis en fullständig eller partiell mekanisk ocklusion av den nedre hålvenen (IVC) med hjälp av en sutur. Denna procedur inducerar en total eller partiell stas av blod och endotelskada, vilket utlöser trombogenes. De nuvarande modellerna har begränsningar som högre variabilitet i koagulationsvikter, betydande dödlighet och förlängd inlärningskurva. Denna rapport introducerar kirurgiska förfiningar med hjälp av vaskulära klämmor för att ta itu med några av dessa begränsningar. Med hjälp av en syngen xenograftmusmodell för koloncancer använde vi skräddarsydda kärlklämmor för att ligera infrarenal vena cava. Dessa klämmor tillåter kvarvarande läpputrymme som liknar en 5-0 polypropensutur efter IVC-ligeringar. Möss med suturmetoden fungerade som kontroller. Vascular clip-metoden resulterade i en konsekvent reproducerbar partiell vaskulär ocklusion och större koagulationsvikter med mindre variabilitet än suturmetoden. De större koagulationsvikterna, den större koagulationsmassan och koaguleringen till IVC-luminalytan förväntades på grund av den högre tryckprofilen för kärlklämmorna jämfört med en 6-0 polypropensutur. Tillvägagångssättet validerades med ultraljud i gråskala, som visade genomgående större koagulationsmassa i infrarenal vena cava med kärlklämmor jämfört med suturmetoden. Dessa observationer bekräftades ytterligare med immunofluorescensfärgningen. Denna studie erbjuder en förbättrad metod för att generera en venös trombosmodell i möss, som kan användas för att fördjupa den mekanistiska förståelsen av CAT och i translationell forskning som läkemedelsutveckling.
Introduction
Cancerassocierad venös tromboembolism (VTE)
Risken för venös tromboembolism (VTE) är 4 till 7 gånger högre hos canceröverlevare jämfört med den allmänna befolkningen 1,2,3. Detta tillstånd visar sig vara dödligt hos en av sju patienter med cancer. Incidensen av VTE varierar beroende på typ av cancer och tumörbörda och är högst bland patienter med bukspottkörtel- och magcancer4.
Cancerassocierad VTE hos cancerpatienter har prognostisk betydelse. Det är förknippat med ogynnsam total överlevnad under det första året efter en cancerdiagnos, även efter justering för ålder, ras och stadium av underliggande cancer5. Dessa fynd belyser vikten av att undersöka cancerassocierad VTE och behovet av att undersöka dess mekanism med hjälp av en djurmodell. Den translationella relevansen av detta område understryks ytterligare av det faktum att VTE hos cancerpatienter kan förebyggas och behandlas med tromboprofylax och antitrombotisk terapi6.
Djurmodeller av cancer och venös trombos
Cancermodeller kallas konventionellt för xenograft, vilket innebär att cancerceller injiceras i möss. Injektionen av cancerceller på ett ställe som dess ursprung kallas en ortotopisk modell, medan på en annan plats (subkutant plan över flanken) är känd som en heterotopisk modell. Cancercellernas ursprungsart bestämmer dem som en allogen modell, såsom HT-29-cellinjen (human tjocktarmscancer)7,8,9. Tvärtom använder syngena modeller murina cancercellinjer, inklusive RenCa- och MC-38-cellinjerna 3,10.
Litteraturen har beskrivit arteriella, venösa och kapillära trombosmodeller hos gnagare. Venös trombos induceras i nedre hålvenen (IVC) genom mekanisk skada (ledare) eller fullständig IVC-ligering, kemisk (järnklorid) eller elektrolytisk skada. Järnklorid-inducerad trombos eller IVC-ligering representerar kompletta ocklusionsmodeller. Det senare resulterar i blodets stas och inflammatoriska infiltrat i venerna11,12,13. Den fullständiga ligeringsmodellen resulterar i en hög grad av trombosbildning hos 95 % till 100 % av mössen. Den partiella IVC-ligeringsmodellen kan inkludera avbrott i laterala iliolumbala grenar, och det venösa återflödet upphävs genom att applicera suturligationer i de distala målpunkterna för IVC12. Ibland används en mellanslagshållare för att delvis avbryta det venösa återflödet. Trombvikten är dock inkonsekvent i den nuvarande partiella ocklusionsmodellen, vilket resulterar i hög variabilitet i koagulationsvikter och höjder12,14.
Båda dessa mekaniska modeller med stora ådror (partiella och fullständiga) har begränsningar. För det första resulterar IVC-ligering (stasismodell) ofta i hypotoni. Blodet shuntas genom kotvenerna. Även om dödligheten med denna modell är i erfarna händer varierar den mellan 5 % och 30 %, och den högre frekvensen förväntas under inlärningskurvan. Det är viktigt att notera att den fullständiga ocklusionsmodellen inte reproducerar djup ventrombos (DVT) hos människa, där en tromb vanligtvis är icke-ocklusiv. Fullständig ocklusion kommer sannolikt att förändra hemorheologiska faktorer och farmakodynamiska parametrar, vilket förändrar biotillgängligheten av föreningar på den lokala platsen. På grund av dessa begränsningar kan det hända att fullständiga ocklusionsmodeller inte är optimala för att testa nya kemiska föreningar för terapeutiska ändamål och läkemedelsupptäckter12.
Det bör noteras att för att ge en mer kliniskt relevant murin modell av venös trombos med minskat flöde med endotelskada har en venös trombosmodell introducerats, där DVT utlöses av begränsning av blodflödet i frånvaro av endotelstörning. Modellen validerades med svepelektronmikroskopi15. En föredragen kliniskt relevant trombosmodell är en med nästan fullständig trombos som möjliggör läkemedelsupptäckter. Blodproppsbildningen i de nuvarande modellerna för partiell ocklusion är inkonsekvent, vilket resulterar i hög variabilitet i koagulationsvikt och höjd12,16. Dessutom varierar koagulationsvikten med de konventionella metoderna, vilket kräver fler möss per studie12.
Tidigare cancerassocierade trombosmodeller fokuserade på tjocktarms-, bukspottkörtel- och lungcancer och var alla kompletta ocklusionsmodeller17,18,19. Detta manuskript modifierar den partiella ocklusionstrombosmodellen för att ge blodproppar med lägre variabilitet och musdödlighet (Figur 1). Tidigare studier använde allogena cancercellinjer på immunsupprimerade atymiska möss bakgrund 19,20,21. Detta manuskript använder ett MC-38 cellsyngent xenograft i C57Bl6/J-möss, vilket möjliggör användning av immunkompetenta möss och undersökning av immunkomponenter till trombogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I en syngen xenograft koloncancermodell observerar vi högre trombogenicitet och uttryck av koagulationsmarkörer i experimentgruppen jämfört med kontrollgruppen. Det är viktigt att notera att variansen i alla dessa parametrar var lägre i experimentgruppen jämfört med kontrollgruppen. Modifieringen innebar att man införde en vaskulär klämma med en specifik tryckprofil vid sammanflödespunkten för IVC och vänster njurven. Klämman placerades över en distans, som var en 5-0 polypropensutur. Denna modifiering mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR, VCC, XY och SL) och R01HL166608 (KR och VCC).
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
Referências
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Pesquisa do Câncer. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Pesquisa do Câncer. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al. May-Thurner syndrome. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
