Etikettfri ytförbättrad Raman-spridningsbioanalys baserad på Au@Carbon punktnanoprober

Summary

I denna studie utvecklade vi en billig ytförbättrad Raman-spridning (SERS)-baserad fingeravtrycksnanosond med gynnsam biokompatibilitet för att visa etikettfri bioimaging av levande celler och detektera två bakteriestammar, vilket visar i detalj hur man får SERS-spektra av levande celler i en icke-destruktiv metod.

Abstract

Ytförstärkt Raman-spridningsteknik (SERS) har väckt mer och mer uppmärksamhet inom det biomedicinska området på grund av dess förmåga att tillhandahålla molekylär fingeravtrycksinformation av biologiska prover, liksom dess potential i encellsanalys. Detta arbete syftar till att upprätta en enkel strategi för etikettfri SERS-bioanalys baserad på Au@carbon dot nanoprobes (Au@CDs). Här används polyfenol-härledda CD-skivor som reduktionsmedel för att snabbt syntetisera kärnskal Au@CD nanostrukturer, vilket möjliggör kraftfull ^{SERS-prestanda} även när koncentrationen av metylenblått (MB) är så låg som 10-9 M, på grund av den kooperativa Raman-förbättringsmekanismen. För bioanalys kan Au@CDs fungera som en unik SERS-nanosensor för att identifiera cellkomponenterna i bioprover (t.ex. cancerceller och bakterier). De molekylära fingeravtrycken från olika arter kan särskiljas ytterligare efter kombination med huvudkomponentanalysen. Dessutom möjliggör Au@CDs etikettfri SERS-avbildning för att analysera intracellulära kompositionsprofiler. Denna strategi erbjuder en genomförbar, etikettfri SERS-bioanalys, vilket öppnar upp för nya möjligheter för nanodiagnos.

Introduction

Encellsanalys är avgörande för studier av avslöjande cellulär heterogenitet och bedömning av cellens omfattande tillstånd. Cellens omedelbara svar på mikromiljön motiverar också encellsanalys¹. Det finns dock vissa begränsningar för de nuvarande teknikerna. Fluorescensdetektering kan tillämpas på encellsanalys, men den begränsas av låg känslighet. Andra utmaningar uppstår från den komplicerade fluorescensbakgrunden hos celler och fluorescensfotoblekningen under långvarig bestrålning². Ytförstärkt Ramanspridning (SERS) kan kvalificera sig när det gäller encellsanalys på grund av dess fördelar, inklusive (1) återspeglar den inneboende molekylära fingeravtrycksinformationen och den momentana situationen, (2) ultrahög ytkänslighet, (3) bekväm multiplexdetektering, (4) hög fotostabilitet, (5) detektion kan kvantifieras för jämförande analys, (6) undvikande av cellulär autofluorescens med NIR-våglängdsexcitation, (7) detektion kan utföras i en cellulär vattenhaltig miljö och (8) detektion kan riktas till en specifik region i cellen ^3,4,5.

Det finns två allmänt erkända mekanismer för att förstå SERS som ett grundläggande fenomen: elektromagnetisk förbättring (EM) som en dominerande orsak och kemisk förbättring (CM). EM hänvisar till, i en given frekvens av det spännande fältet, svängningen av kollektiva elektroner drivna av elektromagnetiska vågor när frekvensen för det infallande ljuset matchar frekvensen av fria elektroner som oscillerar i metallen, vilket ger upphov till ytplasmonresonans (SPR). När lokaliserad SPR (LSPR) inträffar genom den infallande lasern som träffar metallnanopartiklarna (NP), leder det till resonansabsorption eller spridning av det infallande ljuset. Följaktligen kan den elektromagnetiska fältintensiteten hos metall NP förbättras med två till fem ordningar⁴. Nyckeln till den enorma förbättringen av SERS är dock inte en enda metall-NP, utan klyftan mellan två NP, vilket skapar hot spots. CM genereras från två sidor, inklusive (1) interaktioner mellan målmolekyler och metall NP och (2) målmolekyler som kan överföra elektroner till / från metall NP ^4,5. Mer uttömmande detaljer finns i dessa översiktsartiklar ^4,5. Flera lovande metoder för SERS biosensing och avbildning i levande celler har presenterats i tidigare litteratur, till exempel detektion av apoptotiska celler⁶, proteiner i organeller⁷, intracellulära miRNA⁸, cellulära lipidmembran, ⁹cytokiner¹⁰ och metaboliter¹¹ i levande celler, samt identifiering och övervakning av celler genom konfokal SERS-avbildning^{2, 11,12,13}. Intressant nog presenterar etikettfri SERS den unika fördelen med SERS, som kan beskriva interna molekylära spektra⁵.

Ett viktigt problem för etikettfri SERS är ett rationellt och pålitligt substrat. Typiska SERS-substrat är ädelmetall NP på grund av deras utmärkta förmåga att sprida mycket ljus¹⁴. Numera ägnas mer och mer uppmärksamhet åt nanokompositer på grund av deras anmärkningsvärda fysikaliska och kemiska egenskaper och biokompatibilitet. Mer betydelsefullt kan nanokompositer visa bättre SERS-aktivitet på grund av den intensiva EM som induceras av de heta fläckarna på nanohybriderna och ytterligare kemisk förbättring som härrör från andra icke-metalliska material¹⁵. Till exempel använde Fei et al. MoS 2 kvantprickar (QD) som reducerare för att syntetisera Au NP@MoS₂QD nanokompositer för etikettfri nära infraröd (NIR) SERS-avbildning av mus 4T1 bröstcancercell (4T1-celler)¹⁶. Li et al. tillverkade också ett 2D SERS-substrat bestående av Au NP och 2D-hafniumditelluridnanoark för etikettfria SERS-mätningar av livsmedelsburna patogena bakterier¹⁷. Nyligen har kolprickar (CD), bra elektrondonatorer, använts som reduktionsmedel utan andra reduktionsmedel eller bestrålning för att syntetisera Au@carbon punktnanoprober (Au@CDs)¹⁸, som har rapporterats vara effektiva material för att förbättra SERS-aktiviteten baserat på laddningsöverföringseffekten (CT) mellan Au-kärnor och CD-skal ^19,20. Mer än så erkänns CD-skivor som täckmedel och stabilisator för att förhindra att Au NP aggregerar²¹. Dessutom öppnar det fler möjligheter för reaktioner med analyter, eftersom det kan ge ett stort antal bindande och aktiva platser²⁰. Genom att utnyttja ovanstående utvecklade Jin et al. en snabb och kontrollerbar metod för att tillverka Ag@CD NP med unika SERS-egenskaper och utmärkta katalytiska aktiviteter för övervakning av heterogena katalytiska reaktioner i realtid¹⁸.

Här demonstrerades en enkel och billig metod för tillverkning av kärnskal Au@CD SERS-substrat för att identifiera cellulära komponenter och etikettfri SERS-bioimaging, samt för att detektera och differentiera Escherichia coli (E. coli) och Staphylococcus aureus (S. aureus), vilket är lovande för tidig diagnos av sjukdom och en bättre förståelse av cellulära processer.

Protocol

1. Tillverkning av Au@CDs OBS: Figur 1 illustrerar ett tillverkningsförfarande för Au@CDs. Bered CD-lösning med citronsyra (CA) och gallinsyra (GA) via en typisk hydrotermisk behandlingsprocedur18. Tillsätt 100 μl 3,0 mg ml-1 av den beredda CD-lösningen i 200 μl 10 mM klorauriksyra (HAuCl4) (se materialtabell) vid rumstemperatur i 10 s tills en lila suspension…

Representative Results

Tillverkning av Au@CDs illustreras i figur 1. CD-skivorna framställdes från CA och GA via en typisk hydrotermisk process18. Au@CDs syntetiserades snabbt genom att reducera HAuCl4 med CD-skivor i vattenhaltiga medier vid rumstemperatur. Storleken och morfologin hos CD-skivor och Au@CDs kan observeras med TEM och högupplöst (HR) TEM23. De förberedda CD-skivorna är monodispergerade med små storlekar på …

Discussion

Sammanfattningsvis har Au@CDs med ett ultratunt CD-skal på 2,1 nm framgångsrikt tillverkats. Nanokompositerna visar överlägsen SERS-känslighet än rena Au NP. Dessutom har Au@CDs utmärkt prestanda i reproducerbarhet och långsiktig stabilitet. Ytterligare forskning inkluderar att ta Au@CDs som substrat för att utföra SERS-avbildning av A549-celler³¹ och för att detektera två bakteriestammar³². Det har bevisats att Au@CDs kan användas som en ultrakänslig SERS-son…

Materials

10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw