एक सियालिडेज़ उपचार का उपयोग करके पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से डी-सिलिएटेड मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (एमओ-डीसी) उत्पन्न करने के लिए एक अद्वितीय, व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके अलावा, एमओ-डीसी के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन का आकलन करने और मूल्यांकन करने के तरीके कि कैसे सियालिडेज़ उपचार एमओ-डीसी के परिपक्वता स्तर में सुधार करता है, वर्णित हैं।
सियालिक एसिड नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए मोनोसैकराइड होते हैं जो आमतौर पर सेल सतह ग्लाइकेन्स की टर्मिनी में पाए जाते हैं। उनकी हाइड्रोफिलिसिटी और बायोफिज़िकल विशेषताओं के कारण, वे कई जैविक प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मॉड्यूलेशन, स्वयं और गैर-स्व एंटीजन की पहचान, कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन इंटरैक्शन आदि। सियालिक एसिड की सेलुलर सामग्री को सियालिडेज़ द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो सियालिक एसिड अवशेषों को हटाने के लिए उत्प्रेरित करता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि सियालो-ग्लाइकेन प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर सीआईएस और ट्रांस निरोधात्मक सिगलेक रिसेप्टर्स के साथ जुड़कर प्रतिरक्षा निगरानी की निगरानी में महत्वपूर्ण हैं। इसी तरह, कैंसर में ग्लाइको-प्रतिरक्षा चौकियां इम्यूनोथेरेपी विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य बन रही हैं। इसके अतिरिक्त, डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) को इम्यूनोथेरेपी में एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में कल्पना की जाती है, विशेष रूप से कैंसर अनुसंधान में, पेशेवर एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीसी) के रूप में उनकी अनूठी भूमिका और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति उत्पन्न करने की उनकी क्षमता के कारण। फिर भी, डीसी का कार्य उनकी पूर्ण परिपक्वता पर निर्भर है। अपरिपक्व डीसी में परिपक्व डीसी और एक उच्च साइलिक एसिड सामग्री के लिए एक विरोधी कार्य होता है, जो उनके परिपक्वता स्तर को और कम करता है। यह टी-कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए अपरिपक्व डीसी की क्षमता को कम करता है, जिससे एक समझौता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। नतीजतन, मानव डीसी की कोशिका सतह से सियालिक एसिड को हटाने से उनकी परिपक्वता होती है, इस प्रकार एमएचसी अणुओं और एंटीजन प्रस्तुति की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह सह-उत्तेजक अणुओं और आईएल -12 की अभिव्यक्ति को बहाल कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप डीसी में टी-कोशिकाओं को टीएच 1 फेनोटाइप की ओर ध्रुवीकृत करने की उच्च क्षमता होती है और विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए साइटोटोक्सिक टी-कोशिकाओं को सक्रिय किया जाता है। इसलिए, सियालिक एसिड डीसी के एक प्रमुख मॉड्यूलेटर के रूप में उभरा है और उनके चिकित्सीय उपयोग को आगे बढ़ाने के लिए एक नए लक्ष्य के रूप में उपयोग किया जा रहा है। यह अध्ययन सियालिडेज़ के साथ इन विट्रो मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी के इलाज के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसका उद्देश्य विभिन्न सेल सतह साइलिक एसिड फेनोटाइप और अनुरूप परिपक्वता और सह-उत्तेजक प्रोफाइल के साथ डीसी आबादी उत्पन्न करना है।
सियालिक एसिड-ले जाने वाले ग्लाइकेन (सियालोग्लाइकेन्स) ने अपनी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी भूमिका के कारण महत्वपूर्ण रुचि प्राप्त की है। मोनोसैकराइड सियालिक एसिड, जो एन-एसिटाइलन्यूरामिनिक एसिड के रूप में मनुष्यों में सबसे अधिक प्रचलित है, प्रतिरक्षा विज्ञान में मान्यता प्राप्त भूमिका के साथ लेक्टिन के लिए मौलिक लिगेंड प्रस्तुत करता है, जैसे कि सेलेक्टिन और सिगलेक्स। ये लेक्टिन या तो एक ही कोशिका (सीआईएस) या विभिन्न कोशिकाओं (ट्रांस) पर सियालॉगलाइकेन्स को पहचानते हैं और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन और विभिन्न शारीरिक और पैथोलॉजिकलसेलुलर गतिविधियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, चूंकि सियालिक एसिड सेल सतह ग्लाइकोकॉन्जुगेट के टर्मिनल पदों पर कब्जा कर लेता है, इसलिए यह अंतर्निहित संरचनाओं को छिपा सकता है, इस प्रकार गैर-विशिष्ट प्रतिकारक प्रभावों के माध्यम से सेल-टू-सेल संपर्क को बाधित कर सकता है या अन्य लेक्टिन4 द्वारा पता लगाने में बाधा डाल सकता है। कोशिका के भीतर विभिन्न प्रकार के सिएलिट्रांसफेरेज़ (जो सियालिक एसिड को स्थानांतरित करते हैं) और सियालिडेस (जो सियालिक एसिड बॉन्ड को छोड़ देते हैं) की गतिविधि सतह पर मौजूद सियालिक एसिड की मात्रा निर्धारित करती है। इसके अलावा, मेजबान या रोगजनकों द्वारा व्यक्त घुलनशील सिलिलट्रांसफेरेज़ और सियालिडेज़ कोशिका की सतह पर सियालिकएसिड की मात्रा को बाह्य रूप से संशोधित कर सकते हैं।
असामान्य सिनाइलेशन कई रोग स्थितियों की एक विशेषता है। ऑटोम्यून्यून रोगों में, हाइपोसिनाइलेशन अनियंत्रित प्रतिरक्षा सक्रियण और अंग क्षति में योगदान कर सकता है, क्योंकि सियालिक एसिड स्व-एंटीजन को भेदभाव करने औरभड़काऊ प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में मदद करता है। इसके विपरीत, हाइपरसिनाइलेशन के परिणामस्वरूप सियालोग्लाइकेन्स की अति-अभिव्यक्ति होती है, जैसे कि सियालिल-टीएन, सियालिल-लुईस एंटीजन, पॉलीसिलिक एसिड और गैंग्लियोसाइड्स, जो कुछ कैंसर की पहचान 8,9 का गठन करते हैं। हाइपरसिनाइलेशन विशिष्ट एंजाइमों जैसे एन-एसिटाइलग्लुकोसामिनेलट्रांसफेरेज़ (जीएनटी-वी) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति पर भी निर्भर करता है, जो हाइपरसिलीलेटेड ट्राइ- और / या टेट्रा-एंटीनारी एन-लिंक्ड ग्लाइकेन उत्पन्न करता है, जो कैंसर के विकास और मेटास्टेसिस10 से जुड़ा हुआ है। सियालिक एसिड सामग्री प्रोटीन स्थिरता और कार्य को भी नियंत्रित करती है, जो प्रासंगिक ऑन्कोजेनिकखिलाड़ियों की भूमिका के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, बढ़े हुए सिनाइलेशन ट्यूमर के विकास, मेटास्टेसिस, दवा प्रतिरोध और प्रतिरक्षा चोरी की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, सियालॉगलिकेन्स का अपरेग्यूलेशन ट्यूमर को प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर निरोधात्मक सिगलेक रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने और प्रतिरक्षा निगरानी से बचने में सक्षम बनाता है। उस कारण से, सियालोगिकेंस को अब ग्लाइको-प्रतिरक्षा चौकियों और आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य माना जाता है। उदाहरण के लिए, सिगलेक-प्रतिरक्षा अक्ष के अवरोधक पहले से ही प्रारंभिक नैदानिक परीक्षणों में हैं, क्योंकि प्रतिरक्षा कोशिका रिसेप्टर सिगलेक (सियालिक-एसिड-बाइंडिंग इम्युनोग्लोबुलिन-जैसे एलईसीटिन) एक प्रतिरक्षा-निरोधात्मकभूमिका निभाता है।
अध्ययन के लिए उपकरण के रूप में या चिकित्सीय रणनीतियोंके लिए ग्लाइकन प्रोफाइल को संशोधित करने के लिए एंजाइमों का उपयोग किया गया है13,14. सियालिडेज़ को कैंसर सेल मैलिग्नेंसी को बदलने के लिए नियोजित किया गया है क्योंकि सिलीलेटेड ग्लाइकेन जैसे कि सियालिल लुईस एक्स सेल माइग्रेशन और कैंसर मेटास्टेसिस15 के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसी समय, सियालिडेज़ इनहिबिटर, जो सियालिक एसिड क्लीवेज को बाधित करते हैं, सियालिक एसिड-निर्भर वायरल संक्रमण16 के इलाज के लिए क्लीनिक तक पहुंच गए हैं। हाल ही में, सिगलेक-प्रतिरक्षा अक्ष में लिगेंड के रूप में सियालिक एसिड की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण सियालिक एसिड मॉड्यूलेशन ने और रुचि प्राप्त की है, जिसका अर्थ है कि वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से कैंसर के भागने को कम करने के लिए नए साधन प्रदान करते हैं। इस रुचि को 2022 के नोबेल पुरस्कार विजेता बर्टोज़ी और उनकी टीम के कई रणनीतियों के योगदान से और मजबूत किया गया जो चुनिंदा रूप से विविध सियालोगिकन्स को छोड़ देते हैं और कैंसर-विरोधीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सुधार करते हैं। इस प्रकार, सियालिडेज़-आधारित रणनीतियाँ ग्लाइको-प्रतिरक्षा चेकपॉइंट थेरेपी के लिए एक आशाजनक साधन का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं का ग्लाइकोफेनोटाइप सेल के प्रकार और उनकी सक्रियण स्थिति पर निर्भर है। टी-कोशिकाओं के संबंध में, ग्लाइकान की टी-सेल विकास और थाइमोसाइट चयन, टी-सेल गतिविधि, भेदभाव और प्रसारके पैथोफिजियोलॉजिकल चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका है। उदाहरण के लिए, ग्लाइकोप्रोटीन पर पॉलीलैक्टोसामाइन बी लिम्फोसाइटों और टी लिम्फोसाइटों और मैक्रोफेज सक्रियण19 के बेसल स्तर को प्रभावित करता है। मैक्रोफेज में, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) 20 में मैक्रोफेज भर्ती में अलग-अलग ग्लाइकन अभिव्यक्ति पैटर्न की महत्वपूर्ण भूमिका होती है। इसलिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा ओ-लिंक्ड और एन-लिंक्ड ग्लाइकेन की अभिव्यक्ति का उपयोग कैंसर और ऑटोइम्यून बीमारियों के उपचार में चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए संभावित ग्लाइकोबायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है।
डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) विशिष्ट एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाएं हैं जिनमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने की अनूठी क्षमता होती है, जैसे कि एंटी-कैंसर प्रतिरक्षा21। डीसी को टी-कोशिकाओं (सिग्नल 1), सह-उत्तेजक अणुओं को टी-कोशिकाओं (सिग्नल 2) को सक्रिय करने के लिए सह-उत्तेजक अणुओं और आईएल -12 जैसे प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स को पेश करने के लिए अपने एंटीजन-प्रेजेंटिंग एमएचसी अणुओं के अपरेग्यूलेशन से गुजरना होगा, ताकि टाइप 1 हेल्पर टी-सेल प्रसार (सिग्नल 3)22 को ट्रिगर किया जा सके। परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल को कसकर विनियमित किया जाता है, और स्वस्थ कोशिकाओं पर हमला करने से रोकने के लिए चेकपॉइंट आवश्यक हैं। चूंकि डीसी ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ विभिन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकते हैं, इसलिए उनका उपयोग सेल-आधारित टीकों के रूप में किया जाता है, और नैदानिक अध्ययनों की एक बड़ी संख्या ने उनके संभावित लाभों का प्रदर्शन कियाहै। एफडीए द्वारा 201025,26 में पहले डीसी-आधारित टीके को मंजूरी देने के बाद, कई अन्य डीसी-आधारित टीके विकसित किए गए हैं। डीसी-आधारित टीके मुख्य रूप से विवो में उत्पादित होते हैं और ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए रोगियों को प्रशासित किए जाते हैं। हालांकि, अपर्याप्त या संक्षिप्त परिपक्वता वर्तमान में डीसी की नैदानिक प्रभावकारिता को सीमित करने वाले कारकों में से एक है और इसका मतलब है कि महंगे साइटोकिन कॉकटेल का उपयोग किया जाना चाहिए। पर्याप्त परिपक्वता के बिना, डीसी नैदानिक परिस्थितियों में टी-कोशिकाओं को सक्रिय नहीं कर सकते हैं। इसके बजाय, डीसी प्रतिरक्षा चौकियों को व्यक्त करते हैं और एक टोलरोजेनिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं जो साइटोटोक्सिक टी-कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ कार्य करने से रोकता है।
मानव डीसी में भारी सिलिलेटेड सतहहोती है, और परिपक्वता पर और समग्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाके दौरान यह सिनाइलेशन कम हो जाता है। डीसी की परिपक्वता को सियालिडेज़ के साथ इन सियालिक एसिड को खत्म करके प्रेरित किया जा सकता है। न्यूक्लियस 6,28 में एनएफ-केबी ट्रांसक्रिप्शन कारक के स्थानांतरण के कारण आईएल -12 सहित विभिन्न साइटोकिन्स को बहुत अधिक विनियमित करता है। इसके अलावा, डेसिलेशन एमएचसी-आई और एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं29,30 के माध्यम से एंटीजन क्रॉस-प्रस्तुति में सुधार करता है। तदनुसार, सिएलेट्रांसफेरेज़ एसटी 3 गैल.एल और एसटी 6 जीएएल.एल के नॉकआउट, जिनकी डीसी सिनाइलेशन में एक प्रमुख भूमिका है, मुराइन डीसी31 में अधिक परिपक्व फेनोटाइप उत्पन्न करता है।
सियालिडेज़ उपचार डीसी परिपक्वता के सभी पहलुओं को उत्तेजित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जिसमें एंटीजन प्रस्तुति में वृद्धि, सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति में वृद्धि, और साइटोकिन उत्पादन में वृद्धि शामिल है, ताकि ऊपर उल्लिखित कमियों को दूर किया जा सके और डीसी को प्रभावी प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने में सक्षम बनाया जा सके। यह लेख एक बैक्टीरियल सियालिडेज़ के उपयोग के माध्यम से व्यवहार्य डेसिलिएटेड मानव डीसी प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। डी-सिलीलेटेड डीसी एक बेहतर परिपक्वता प्रोफ़ाइल दिखाते हैं और विट्रो में एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए सेल मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। डीसी रक्त मोनोसाइट्स से प्राप्त किए जाते हैं, जिन्हें तब साइटोकिन इंटरल्यूकिन -4 (आईएल -4) और ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) की उपस्थिति में विट्रो में विभेदित किया जाता है। यह काम सेल की सतह पर सियालिक एसिड का विश्लेषण करने के लिए लेक्टिन-आधारित तरीकों और डीसी परिपक्वता स्तर पर इम्यूनोफेनोटाइप के तरीकों का भी वर्णन करता है। यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग अन्य सेल प्रकारों को व्यवस्थित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार सियालोग्लाइकेन्स की भूमिका की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो महत्वपूर्ण ग्लाइको-प्रतिरक्षा चौकियां हैं और इम्यूनोमॉड्यूलेशन में प्रासंगिक हैं।
मोनोसाइट अलगाव;
यह पांडुलिपि मानव-पृथक मोनोसाइट्स सीडी 14 + (चित्रा 1 ए) से मो-डीसी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, इसके बाद इन कोशिकाओं की सतह पर सियालिक एसिड सामग्री को कम करने के लिए एक सियालिडेज़ उपचार किया जाता है।
मानव डीसी प्राप्त करने के विभिन्न तरीके हैं, जैसे कि परिधीय रक्त या ऊतकों से सीधे या स्टेम सेल या मोनोसाइट्स जैसे अग्रदूतों से भेदभाव के माध्यम से। परिधीय रक्त से अलग मोनोसाइट्स से विभेदित डीसी प्राप्त करना अन्यडीसी स्रोतों की तुलना में उच्च मात्रा में मोनोसाइट्स प्राप्त करने में आसानी के कारण कहीं अधिक सरल है। फिर भी, पृथक मोनोसाइट्स का एक उच्च प्रतिशत प्राप्त करने के लिए, सभी प्रोटोकॉल चरणों का सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, घनत्व ढाल माध्यम कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है, और कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए, किसी को घनत्व ढाल माध्यम के साथ लंबे समय तक सेल संपर्क से बचना चाहिए और कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोना चाहिए। सेल व्यवहार्यता के नुकसान से बचने के लिए सेल हेरफेर को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। पीबीएमसी से, मोनोसाइट्स को चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) विधि का उपयोग करके सकारात्मक चयन के माध्यम से अलग किया जा सकता है, जो उच्च संख्या में मोनोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक है। इसके अलावा, अन्य मोनोसाइट चयन विधियों की तुलना में, एमएसीएस-पृथक मोनोसाइट्स से प्राप्त मो-डीसी में एंटी-ट्यूमर टी-सेल गतिविधिको उत्तेजित करने की अधिक क्षमता होती है। इस प्रोटोकॉल में, एक बार अलग होने के बाद, मोनोसाइट्स को अपरिपक्व एमओ-डीसी (चित्रा 1) में भेदभाव प्राप्त करने के लिए 5-6 दिनों की अवधि के लिए आईएल -4 और जीएम-सीएसएफ के साथ इनक्यूबेट किया गया था। परिणामों से पता चला कि रूपात्मक (चित्रा 1 ए) और फेनोटाइपिक रूप से (चित्रा 1 बी), पृथक मोनोसाइट्स अपरिपक्व मो-डीसी में विभेदित होते हैं। इसके अलावा, भेदभाव के दौरान, एमओ-डीसी ने सीडी 14 मार्करों की अभिव्यक्ति खो दी और सीडी 1 ए और एमएचसी -2 (चित्रा 1 बी) की अभिव्यक्ति प्राप्त की, जो टी-कोशिकाओं को एंटीजन प्रस्तुति के लिए आवश्यक हैं।
मो-डीसी में मोनोसाइट्स का यह अलगाव और भेदभाव इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं। अलगाव प्रक्रिया एक संवेदनशील कदम है जिसे कोशिका मृत्यु से बचने के लिए सावधानीपूर्वक और तेजी से निष्पादित किया जाना चाहिए, और यह कदम हर बार एक नए प्रयोग के लिए मो-डीसी की आवश्यकता होने पर भी किया जाना चाहिए। भेदभाव प्रक्रिया में 5-6 दिन लगते हैं जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए इस विधि को नियोजित करने के मामले में कठिनाई पैदा करता है। बहरहाल, अलगाव विधि और मो-डीसी को अलग करने के लिए साइटोकिन्स का उपयोग प्रयोग उद्देश्यों के लिए विट्रो में उच्च संख्या में कार्यात्मक मो-डीसी उत्पन्न करने के लिए उपयोगी हैं। इस प्रोटोकॉल में उत्पन्न मो-डीसी सियालिडेज़ उपचार, फ्लो साइटोमेट्री, एलिसा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, और इतने पर से गुजरने में सक्षम हैं, इस प्रकारइस विधि के महत्व और उपयोगिता पर जोर देते हैं।
अपरिपक्व मो-डीसी और सियालिडेज़ उपचार।
सियालिडेज़ सिनाइलेशन विनियमन में आवश्यक हैं और सेल सतह ग्लाइकेन से सियालिक एसिड को हटाने के लिए जिम्मेदार हैं। मो-डीसी में, सियालिडेज़ द्वारा सियालिक एसिड हटाने से इन कोशिकाओं की परिपक्वता होती है, जो एंटीजन-क्रॉस प्रस्तुति और बाद में टी-सेल सक्रियण और एंटी-ट्यूमर गतिविधि30 को बढ़ाती है।
परिपक्व एमओ-डीसी31,43 की तुलना में अपरिपक्व मानव एमओ-डीसी सेल सतह α (2,6)- और α (2,3)-लिंक्ड सियालिक एसिड27 की उच्च सामग्री प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, सियालिडेज़ के साथ मो-डीसी का इलाज करके सियालिक एसिड को हटाने से डीसी 28,30,31 की परिपक्वता में सुधार होता है। इस प्रयोग के लिए चुना गया सियालिडेज़ जीवाणु क्लोस्ट्रीडियम पेरिंजन्स से था।फिर भी, अन्य जीव भी सियालिडेस का उत्पादन करते हैं, जैसे कि बैक्टीरिया स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, विब्रियो कोलेरा, या साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम44, जोंक मैकरोडेला डेकोरा45, और यहां तक कि होमो सेपियन्स46, और इन जीवों से सियालिडेज़ का भी प्रयोगात्मक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, प्रत्येक सियालिडेज़ में अलग-अलग सब्सट्रेट विशिष्टताएं होती हैं। इसके अतिरिक्त, सियालिडेज़ एंजाइम का उपयोग करने की अपनी सीमाएं हो सकती हैं; उदाहरण के लिए, उपचार के दौरान एमओ-डीसी का हेरफेर इन कोशिकाओं को और उत्तेजित कर सकता है। इसके अलावा, सियालिडेज़ की मात्रा और इनक्यूबेशन समय का उपयोग की जा रही कोशिकाओं के प्रकार और उनकी सियालिक एसिड संरचना के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। सियालिक एसिड हटाने एक स्थायी प्रभाव नहीं है, बल्कि एक क्षणिक घटना है, क्योंकि सेल अपनी सेल सतह सियालिक एसिड सामग्री को बहाल करेगा। सियालिडेज़ के अलावा, कोशिकाओं की सतह पर सियालिक एसिड अणुओं को कम करने के अन्य तरीके हैं, जैसे कि सिएलिट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर का उपयोग करना, सिएलिट्रांसफेरेज़ जीन के जीन नॉकआउट, या सियालिक एसिड मिमेटिक्स47,48,49 का उपयोग करके सियालिक एसिड की चयापचय नाकाबंदी। बहरहाल, ये विधियां कोशिकाओं पर अलग-अलग प्रभाव पेश कर सकती हैं, और डिसिलेशन के अलावा, सेल व्यवहार्यता पर विचार किया जाना चाहिए। सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए सेल सतह साइलिक एसिड को प्रभावी ढंग से और क्षणिक रूप से हटाने के लिए सियालिडेज़ एंजाइम उपचार एक व्यावहारिक विधि है।
इस काम में, 500 mU / 5 x 106 कोशिकाओं / mL की एकाग्रता पर अपरिपक्व mo-DCs में सियालिडेज़ जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को 60 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट किया गया था। सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने और सीरम 30 में मौजूद सिलिलेटेड अणुओं के बीच किसी भी बातचीत से बचने के लिए सीरम के बिना आरपीएमआई –1640 का उपयोग करके उपचार किया गया था। सियालिडेज़ उपचार आरपीएमआई के अलावा अन्य बफर के साथ किया जा सकता है, जैसे कि 50 एमएम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.1 (सी परफिंगेंस सियालिडेज़ के मामले में), या पीबीएस50,51,52। बहरहाल, आरपीएमआई -1640 डीसी के लिए सबसे आम संस्कृति माध्यम है क्योंकि यह प्रक्रिया के दौरान निरंतर प्रयोगात्मक स्थितियों को बनाए रखता है, परिपक्वता को प्रेरित करने से बचता है, और किसी भी तनाव को कम करता है जो सियालिडेज़ बफर या पीबीएस53,54,55,56 के कारण हो सकता है। सियालिडेज़ के साथ इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को सीरम-पूरक माध्यम से अच्छी तरह से धोना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एंजाइम प्रतिक्रिया बंद हो गई है। सीरम में सिलिलेटेड अणुओं की उपस्थिति सियालिडेज़ के लिए सब्सट्रेट के रूप में प्रतिस्पर्धा करेगी, इस प्रकार तेजी से प्रतिक्रिया रोकने का आश्वासन देगी।
फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सतह मार्कर लक्षण वर्णन।
साइलिक एसिड प्रोफाइल के निर्धारण के लिए, प्रोटोकॉल खंड 3 में, हमने फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के बाद लेक्टिन स्टेनिंग का उपयोग किया। सेल धुंधला प्रक्रिया के लिए, दोनों मामलों में, लेक्टिन सांद्रता और इनक्यूबेशन स्थितियों को सेल एग्लूटीनेशन और मृत्यु से बचने के लिए अनुकूलित किया गया था। लेक्टिन के गैर-विशिष्ट बंधन से बचने के लिए एफबीएस या बीएसए के कम से कम 2% वाले बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, 10% एफबीएस युक्त आरपीएमआई -1640 का उपयोग निरंतर प्रयोगात्मक स्थितियों को बनाए रखने और सेल तनाव से बचने के लिए किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के संबंध में, आकृति विज्ञान को संरक्षित करने, ऑटोलिसिस को रोकने और एंटीजेनिसिटी को बनाए रखने के लिए धुंधला होने से पहले कोशिकाओं का निर्धारण आवश्यक है।
फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मो-डीसी फेनोटाइप के विश्लेषण से पता चला है कि सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी में एमएमए और एसएनए लेक्टिन की तुलना में सेल की सतह से बंधे पीएनए लेक्टिन की काफी अधिक मात्रा थी, जो सियालिडेज़ उपचार के बाद कम हो गई (चित्रा 2 ए)। जैसा कि अपेक्षित था, पीएनए धुंधलापन बढ़ गया, क्योंकि पीएनए एमएए और एसएनए के विपरीत गैर-सिलीलेटेड एंटीजन को पहचानता है, जो क्रमशः 2,3- और 2,6-सियालिक एसिड से सीधे जुड़तेहैं। यह धुंधलापन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सेल की सतह से सियालिक एसिड के प्रभावी निष्कासन की पुष्टि करता है। एक अन्य विधि जिसका उपयोग उपचार को मान्य करने और सेल सतह साइलिक एसिड सामग्री का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, वह लेक्टिन धुंधला है, जिसके बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी है, जैसा कि चित्रा 2 बी में उदाहरण दिया गया है।
पूर्व उदाहरणों के अलावा, सियालिक एसिड सामग्री का मूल्यांकन और विशेषता करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूद हैं, जैसे कि पश्चिमी सोख्ता द्वारा लेक्टिन जांच। वैकल्पिक साइलिक एसिड-विशिष्ट लेक्टिन भी उपलब्ध हैं, जैसे कि सिगल्स, लेक्टिन का एक समूह जिसमें साइलिक एसिड प्रकारों और लिंकेज57 के लिए एक अलग प्राथमिकता है। किसी भी तकनीक (फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोस्कोपी, या वेस्टर्न ब्लॉट) में लेक्टिन का उपयोग करने के अलावा, एंटीबॉडी का उपयोग करके सियालिक एसिड सामग्री को चिह्नित करना भी संभव है; उदाहरण के लिए, 2,8-सियालिक एसिड का मूल्यांकन क्लोन 735 जैसे एंटीबॉडी द्वारा किया जा सकता है, जो पॉलीसिलिक एसिड58 के लिए विशिष्ट है। इसके अलावा, सियालिडेज़ उपचार के बाद, कोशिकाओं को उनके फेनोटाइप और टी-कोशिकाओंको सक्रिय करने की क्षमता का मूल्यांकन करके उनकी जैविक या चिकित्सीय दक्षता के लिए कार्यात्मक रूप से परीक्षण किया जा सकता है। वास्तव में, जैसा कि प्रदान किए गए उदाहरणों में दिखाया गया है, सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी ने उच्च परिपक्वता फेनोटाइप दिखाया, साथ ही एंटीजन-प्रेजेंटिंग और सह-उत्तेजक अणुओं की एक उन्नत अभिव्यक्ति भी दिखाई।
इसके अलावा, सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी को एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है और टी-कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत किया जा सकता है और फिर फेनोटाइप, साइटोकिन स्राव प्रोफ़ाइल या अन्य विशेषताओं के बारे में अध्ययन किया जा सकता है। प्रदान किए गए उदाहरण में, डेटा से पता चलता है कि सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी को ट्यूमर एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है और फिर टी-कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वास्तव में, परिणामी टी-कोशिकाओं ने आईएफएन -γ स्राव में वृद्धि दिखाई, जो टी-कोशिकाओं 27,28,29,30,31 को सक्रिय करने के लिए एमओ-डीसी की क्षमता को बढ़ाने पर सियालिक एसिड की कमी के प्रभाव पर पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल सियालिडेज़ के साथ उपचार द्वारा सियालिक एसिड सामग्री हेरफेर के लिए एमओ-डीसी उत्पन्न करने के लिए एक व्यवहार्य, व्यवहार्य और व्यावहारिक विधि दिखाता है। यह प्रोटोकॉल एक पद्धति प्रस्तुत करता है जो विभिन्न उद्देश्यों और अनुप्रयोगों की सेवा कर सकता है। यह विधि न केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परिपक्वता और प्रतिक्रिया में सियालिक एसिड की भूमिका को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है, बल्कि इसका उपयोग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी टूल के रूप में भी किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक यूरोपीय आयोग ग्लाइकोट्विनिंग जीए 101079417 और ईजेपीआरडी / 0001/2020 यूरोपीय संघ 825575 से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं; एफसीटी 2022.04607.पीटीडीसी, यूआईडीपी/04378/2020, यूआईडीबी/04378/2020 (यूसीआईबीओ), और एलए/पी/0140/2020 (आई4एचबी) अनुदान के तहत पुर्तगाल के लिए फंडाको को मंजूरी दी गई है। एफसीटी-नोवा। और स्टेममैटर्स को फंडो यूरोपू डी डेसेनवोल्विमेंटो रीजनल (फेडर) द्वारा भी वित्त पोषित किया गया था, जो एसआई आई एंड आई के लिए प्रोग्राम ओपेरा रीजनल डो नॉर्ट (नॉर्ट 2020) के माध्यम से था। डीटी डीसीमैटर्स परियोजना (NORTE-01-0247-FEDER-047212)। हम एफसीटी-नोवा और ग्लाइकोविड नोवा साउड में बायोलैब्स सुविधा को स्वीकार करते हैं।
15 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E15-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662 160 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
50 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E50-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend | 420404 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Annexin V | Immunotools | 31490013 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs | |
BSA | Sigma – Aldrich | A3294-100G | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile |
CD14 (Monoclonal TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
CD80 | Immunotools | 21270803 | Maturation Profiling of mo-DCs |
CD86 | Immunotools | 21480863 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Cell counting slides and trypan blue | EVE | EVS-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Density gradient medium (Histopaque) | Sigma – Aldrich | 10771-100ML | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
EDTA | Gibco, ThermoFisher | 15400054 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Elisa kit (IFN-γ) | Immunotools | 31673539 | Maturation Profiling of mo-DCs |
EVE automated cell count | NanoEntek | 10027-452 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500064 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-093-864 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-1β | Sigma – Aldrich | I9401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-4 | Miltenyi Biotec | 130-093-919 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-6 | Sigma – Aldrich | SRP3096 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
LS column and plunger | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1265-1 | Determination of Sialic Acid Profile |
MHC-I (HLA-ABC) | Immunotools | 21159033 | Maturation Profiling of mo-DCs |
MHC-II (HLA-DR) | Immunostep | HLADRA-100T | Maturation Profiling of mo-DCs |
Microtubes | AstiK’s | PCRP-E015-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Neuraminidase (Sialidase) | Roche | 11585886001 | Treatment of Cells with Sialidase |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Paraformaldehyde (PFA 2%) | Polysciences Europe | 25085-1 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Paraformaldehyde (PFA 4%) | Biotium | 22023 | Determination of Sialic Acid Profile |
Pasteur pipettes | Labbox | PIPP-003-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1071 | Determination of Sialic Acid Profile |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140163 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | NZYTech | MB18201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Sigma – Aldrich | P0409 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RBC lysis buffer | BioLegend | 420302 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) | Gibco | 31870074 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1305-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1301-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sodium pyruvate | Thermofisher | 11360-070 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
SpectroMax190 | Molecular Devices | Maturation Profiling of mo-DCs | |
Streptavidin-PE | BioLegend | 405203 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma – Aldrich | T0440 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) | Sigma – Aldrich | H8916 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Zeiss LSM710 confocal microscope | Zeiss | Determination of Sialic Acid Profile |