Summary

वयस्क ज़ेब्राफिश के व्यवहार में फोरब्रेन गतिविधि की दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Published: July 28, 2023
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Summary

यहां, हम वयस्क ज़ेबराफिश के पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

वयस्क ज़ेब्राफ़िश (डेनियो रेरियो) संज्ञानात्मक कार्यों का अध्ययन करने के लिए व्यवहार का एक समृद्ध प्रदर्शन प्रदर्शित करता है। उनके पास एक लघु मस्तिष्क भी है जिसका उपयोग ऑप्टिकल इमेजिंग विधियों के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों में गतिविधियों को मापने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, वयस्क ज़ेबराफ़िश के व्यवहार में मस्तिष्क गतिविधि की रिकॉर्डिंग पर रिपोर्ट दुर्लभ रही है। वर्तमान अध्ययन वयस्क ज़ेबराफिश के पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। हम वयस्क ज़ेब्राफ़िश को अपने सिर को हिलाने से रोकने के कदमों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो स्थिरता प्रदान करता है जो मस्तिष्क गतिविधि की लेजर स्कैनिंग इमेजिंग को सक्षम बनाता है। सिर-नियंत्रित जानवर स्वतंत्र रूप से अपने शरीर के अंगों को हिला सकते हैं और एड्स के बिना सांस ले सकते हैं। प्रक्रिया का उद्देश्य सिर संयम सर्जरी के समय को कम करना, मस्तिष्क की गति को कम करना और दर्ज न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करना है। कैल्शियम इमेजिंग के दौरान एक इमर्सिव दृश्य वातावरण प्रस्तुत करने के लिए एक सेटअप भी यहां वर्णित है, जिसका उपयोग नेत्रहीन ट्रिगर व्यवहार ों के अंतर्निहित तंत्रिका सहसंबंधों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतक या सिंथेटिक रंगों के साथ कैल्शियम फ्लोरेसेंस इमेजिंग गैर-मानव प्राइमेट्स, कृन्तकों, पक्षियों और कीड़ों सहित व्यवहार करने वाले जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि को मापने का एक शक्तिशाली तरीका रहाहै। मस्तिष्क की सतह के नीचे लगभग 800 μm तक सैकड़ों कोशिकाओं की गतिविधि को मल्टी-फोटॉन इमेजिंग 2,3 का उपयोग करके एक साथ मापा जा सकता है। आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरोनल आबादी में कैल्शियम संकेतक व्यक्त करके विशिष्ट सेल प्रकारों की गतिविधि को भी मापा जा सकता है। छोटे कशेरुक मॉडल के लिए इमेजिंग विधि का अनुप्रयोग मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरोनल गणना के क्षेत्र में नई संभावनाएं खोलता है।

जेब्राफिश तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल सिस्टम है। निषेचन के लगभग 6 दिनों के बाद लार्वा जेब्राफिश का उपयोग उनके लघु मस्तिष्क औरपारदर्शी शरीर के कारण कैल्शियम इमेजिंग के लिए किया गया है। किशोर ज़ेब्राफ़िश (3-4 सप्ताह पुराना) का उपयोग सेंसरिमोटर मार्ग 5,6 के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। हालांकि, साहचर्य सीखने और सामाजिक व्यवहार सहित जटिल व्यवहारों के लिए अधिकतम प्रदर्शन स्तर, 7,8 वर्ष की आयु में पहुंच जाता है। इस प्रकार, इमेजिंग विधियों का उपयोग करके वयस्क ज़ेब्राफिश के दिमाग में कई संज्ञानात्मक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। जबकि जेब्राफिश लार्वा और किशोर जेब्राफिश को विवो इमेजिंग में अगारोस में एम्बेडेड किया जा सकता है, 2 महीने या उससे अधिक उम्र की वयस्क ज़ेब्राफ़िश ऐसी स्थितियों में हाइपोक्सिया से पीड़ित होती हैं और शारीरिक रूप से इतनी मजबूत होती हैं कि उन्हें अगारोस द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, मस्तिष्क को स्थिर करने और जानवर को गलफड़ों के माध्यम से स्वतंत्र रूप से सांस लेने में सक्षम बनाने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।

यहां, हम एक हेड संयम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एकल हेड बार का एक नया डिजाइन शामिल है। 25 मिनट का कम सर्जरी का समय पिछली विधि9 की तुलना में दोगुना तेज है। हम रिकॉर्डिंग कक्ष (अर्ध-हेक्सागोनल टैंक), हेड स्टेज औरदो भागों 9 को संयोजित करने के लिए एक त्वरित-लॉक तंत्र के डिजाइन का भी वर्णन करते हैं। अंत में, नेत्रहीन ट्रिगर मस्तिष्क गतिविधि और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक इमर्सिव दृश्य उत्तेजना पेश करने के लिए सेटअप भी वर्णित है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग सिर-संयमित वयस्क ज़ेबराफ़िश में आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल आबादी में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न व्यवहार प्रतिमानों के दौरान मस्तिष्क की गतिविधियों की जांच सक्षम हो सकती है।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को अकादमिक सिनिका की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार अनुमोदित और किया गया था। अनुसंधान उपकरणों का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है?…

Representative Results

प्रोटोकॉल में दो भाग होते हैं: सिर संयम सर्जरी और फोरब्रेन में न्यूरोनल गतिविधियों की दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग। सर्जरी की सफलता को जानवर के अस्तित्व और सिर संयम की स्थिरता से परिभाषित किया गया है। सर…

Discussion

यहां, हम दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग के लिए वयस्क ज़ेबराफिश के सिर को रोकने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सिर संयम प्राप्त करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं जो लेजर स्कैनिंग इमेजिंग के ल?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को आणविक जीव विज्ञान संस्थान, एकेडेमिया सिनिका, और राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद, ताइवान द्वारा समर्थित किया गया था। भौतिकी संस्थान, एकेडेमिया सिनिका में मशीन शॉप ने कस्टम-डिज़ाइन किए गए भागों को बनाने में मदद की। हम हेड स्टेज के त्वरित-लॉक तंत्र के डिजाइन के लिए पी आर्गास्ट (फ्रेडरिक मिशर इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल रिसर्च, बेसल, स्विट्जरलैंड) को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

Referências

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Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

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