Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징
Summary
여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.
Abstract
초파리 신경 줄기 세포(신경아세포, 이하 NB)는 비대칭 분열을 거쳐 자가 재생 신경아세포를 재생하는 동시에 분화 신경절 모세포(GMC)를 형성하며, 이 세포는 두 개의 뉴런 또는 신경교를 생성하기 위해 한 번의 추가 분열을 겪습니다. NB에 대한 연구는 세포 극성, 방추 방향, 신경 줄기 세포 자가 재생 및 분화의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝혀냈습니다. 이러한 비대칭 세포 분열은 생세포 이미징을 통해 쉽게 관찰할 수 있으므로 유충 NB는 생체 조직에서 비대칭 세포 분열의 시공간 역학을 조사하는 데 이상적입니다. 영양이 보충된 배지에서 적절하게 해부되고 이미지화되면 외식편 뇌의 NB는 12-20시간 동안 강력하게 분열합니다. 이전에 설명한 방법은 기술적으로 어렵고 현장을 처음 접하는 사람들에게는 어려울 수 있습니다. 여기에서는 지방 체내 보충제를 사용하여 살아있는 제3성 유충 뇌 외식편의 준비, 해부, 장착 및 이미징에 대한 프로토콜이 설명됩니다. 잠재적인 문제에 대해서도 논의하고 이 기술을 사용할 수 있는 방법에 대한 예가 제공됩니다.
Introduction
비대칭 세포 분열(ACD)은 RNA, 단백질 및 세포 소기관과 같은 세포 내 구성 요소가 딸 세포 사이에서 불균등하게 분할되는 과정입니다 1,2. 이 과정은 줄기 세포에서 흔히 볼 수 있으며, 줄기 세포는 ACD를 거쳐 다른 발달 운명을 가진 딸 세포를 생성합니다. 초파리 NB는 비대칭으로 분열하여 줄기를 유지하는 하나의 NB와 하나의 신경절 모세포(GMC)를 생성합니다. GMC는 분화 뉴런 또는 신경교를 생성하기 위해 추가 분열을 겪습니다3. 비대칭적으로 분열하는 NB는 현미경을 통해 쉽게 관찰할 수 있는 제3 유충의 발달 중인 뇌에 풍부합니다. 세 번째 instar 애벌레 단계에는 각 중앙 뇌엽 3,4,5,6에 약 100개의 NB가 존재합니다.
비대칭 세포 분열은 매우 역동적인 과정입니다. 생세포 이미징 프로토콜은 세포 극성 7,8,9,10, 방추 방향11,12,13, 악토미오신 피 질 14,15,16,17,18의 역학, 미세소관 및 중심체 생물학 19,20의 역학을 측정하고 정량화하는 데 사용되었습니다,21,22,23,24,25,26,27, 멤브레인10,28 및 염색질 역학 29. ACD에 대한 정성적 및 정량적 설명은 온전한 살아있는 뇌에서 NB를 분할하는 이미지를 위한 강력한 방법과 프로토콜에 의존합니다. 다음 프로토콜은 두 가지 다른 장착 접근 방식을 사용하여 생체 내 생세포 이미징을 위해 세 번째 instar 유충 뇌를 준비, 해부 및 이미지화하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 줄기 세포 분열의 시공간 역학과 다른 뇌 세포의 분열에 관심이 있는 연구자에게 가장 적합하며, 세포 사건의 단기 및 장기 관찰이 가능하기 때문입니다. 또한 이러한 기술은 현장에 새로 온 사람들이 쉽게 접근할 수 있습니다. 우리는 형광 표지가 부착된 미세소관 및 피질 융합 단백질을 발현하는 유충 뇌를 통해 이 접근 방식의 효과와 적응성을 입증합니다. 우리는 또한 분석 방법과 다른 연구에 적용하기 위한 고려 사항에 대해 논의합니다.
Protocol
참고: 그림 1 은 이 연구를 수행하는 데 필요한 자료를 보여줍니다. 1. 실험에 대한 고려 사항 및 준비 애벌레가 과밀하는 것을 방지하십시오.참고: 이식편 유충 뇌의 품질은 해부 전 유충의 건강 및 품질과 직접적인 관련이 있습니다. 과밀로 영양실조에 걸린 유충은 일반적으로 뇌의 질이 낮다(30).영양실조?…
Representative Results
Pins::EGFP 및 Cherry::Jupiter를 발현하는 중추 뇌엽 NB의 해부 및 이미징이 프로토콜을 보여주기 위해 UAS 구동 Cherry::Jupiter13 및 내인성 태그가 지정된 Pins::EGFP16(w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb)는 멀티웰 이미징 슬라이드를 사용하여 설명된 프로토콜을 사용하여 4시간 동안 이미지화되었습니다(그림 5C,D). U…
Discussion
이 프로토콜은 Drosophila melanogaster 유충에서 살아있는 외식편 뇌의 이미징을 위한 한 가지 접근 방식을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 올바른 실험 조건에서 체외이식편 뇌를 12-20시간 동안 관찰할 수 있도록 합니다. 샘플 준비와 원하는 실험의 설계에 특별한 고려가 이루어져야합니다. 위에서 언급했듯이 해부 된 조직의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나는 유충의 건강입?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 R35GM148160(C.C.) 및 국립보건원(NIH) 교육 보조금 T32 GM007270(R.C.S)의 지원을 받습니다
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Referências
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Citar este artigo
Segura, R. C., Cabernard, C. Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains. J. Vis. Exp. (196), e65538, doi:10.3791/65538 (2023).