Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada
Summary
Um protocolo é apresentado para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de produtos farmacêuticos (PD) e detecção de peptídeos usando esferas de enriquecimento de proteoma. O método é demonstrado usando uma substância medicamentosa (MD) de anticorpos monoclonais (mAb) fabricada internamente, que é um material de referência bem caracterizado para avaliar e comparar diferentes métodos em termos de desempenho.
Abstract
As proteínas da célula hospedeira (HCPs) são impurezas que podem afetar adversamente as proteínas terapêuticas, mesmo em pequenas quantidades. Para avaliar os riscos potenciais associados aos medicamentos, métodos têm sido desenvolvidos para identificar PCH de baixa abundância. Uma abordagem crucial para o desenvolvimento de um método sensível de detecção de HCP envolve o enriquecimento de HCPs e, simultaneamente, a remoção de anticorpos monoclonais (mAbs) antes da análise, utilizando cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS).
Este protocolo oferece instruções detalhadas para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira usando esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis. Essas esferas contêm uma biblioteca diversificada de ligantes hexapeptídicos com afinidades específicas para diferentes proteínas. O protocolo também incorpora digestão limitada e subsequente detecção de peptídeos usando nano LC-MS/MS. Ao empregar essas técnicas, HCPs com baixa abundância podem ser enriquecidos mais de 7000 vezes, resultando em um limite de detecção impressionante tão baixo quanto 0,002 ppm. Significativamente, este protocolo permite a detecção de 850 HCPs com um alto nível de confiança usando um mAb do NIST. Além disso, ele foi projetado para ser fácil de usar e inclui uma demonstração em vídeo para ajudar na sua implementação. Ao seguir essas etapas, os pesquisadores podem efetivamente enriquecer e detectar PCHs, aumentando a sensibilidade e a precisão da avaliação de risco para produtos farmacêuticos.
Introduction
As proteínas da célula hospedeira (PCH) são impurezas liberadas da cultura celular do organismo hospedeiro e copurificadas com anticorpo monoclonal (mAb)1,2,3,4. Níveis traço de PID podem afetar negativamente a qualidade do medicamento 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, portanto, um método de análise sensível de PID é desejado para detectar PID em níveis sub-ppm a ppm.
Métodos ortogonais podem ser aplicados para detectar PCH em baixa abundância. O ensaio imunoenzimático (ELISA) é geralmente usado para quantificar HCPs globais, e também pode detectar e quantificar HCPs individuais se os anticorpos correspondentes estiverem disponíveis16. No entanto, a produção de anticorpos específicos para o HCP é demorada e trabalhosa. Em contraste, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) pode fornecer informações abrangentes sobre PCH individuais em medicamentos mAb e é amplamente aplicada para identificação de PCH 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para detectar PCH com LC-MS/MS, incluindo digestão limitada20, filtração17, deleção da proteína A21, imunoprecipitação (IP) e enriquecimento com ProteoMiner (PM)18. A maioria dos métodos visa reduzir a quantidade de mAb e enriquecer HCPs antes da análise de LC-MS/MS, diminuindo assim a faixa dinâmica entre peptídeos mAb e peptídeos HCP. Este protocolo apresenta um método de enriquecimento proteômico de amostras que combina a tecnologia ProteoMiner e digestão limitada (PMLD)28. O princípio de enriquecimento do ProteoMiner envolve o uso de esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis contendo uma biblioteca diversificada de ligantes peptídicos combinatórios. Esses ligantes ligam-se especificamente a proteínas em produtos anticorpos-fármacos, permitindo a remoção de moléculas em excesso enquanto concentram proteínas de baixa abundância de células hospedeiras (HCPs) em seus respectivos ligantes de afinidade. Por outro lado, o princípio da digestão limitada envolve o uso de uma baixa concentração de tripsina. Esta concentração é suficiente para digerir HCPs de baixa abundância, mas não suficiente para digerir todos os produtos de drogas de anticorpos. Esta abordagem permite a recuperação e o enriquecimento de peptídeos HCP digeridos da solução.
Comparada aos métodos de filtração, a técnica de DLPM não é limitada pelo tamanho dos PID detectados17. Os métodos de deleção da proteína A são específicos para detectar HCPs associados a anticorpos21, enquanto a imunoprecipitação é restrita a HCPs predefinidos de uma linhagem celular particular (como a linhagem celular Chinese Hamster Ovary (CHO)), onde um anticorpo anti-HCP foi gerado4. Em contraste, PMLD pode ser aplicado para detectar HCPs de qualquer módulo de drogas e proteínas da célula hospedeira co-purificadas com produtos de drogas de várias linhagens celulares. Além disso, a DLPM apresenta melhor sensibilidade em relação aos métodos citados 17,18,20,21,24.
Essa abordagem pode enriquecer a concentração de HCP em 7000 vezes e reduzir o limite de detecção para 0,002 ppm28. O arranjo experimental está ilustrado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem duas versões de esferas de enriquecimento de proteínas disponíveis comercialmente: uma com menor capacidade e outra com maior capacidade (ver Tabela de Materiais). Ambas as versões das contas de enriquecimento contêm dez preparações no pacote. As instruções do fabricante sugerem que cada preparação do kit de pequena capacidade pode ser usada para enriquecer 10 mg de proteína total. No entanto, para um ótimo desempenho do enriquecimento da proteína da célula hospedeira (HCP) a parti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
Referências
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
