RNA-fluorescentie in situ hybridisatie voor lange niet-coderende RNA-lokalisatie de menselijke osteosarcoomcellen
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode van RNA-fluorescentie in situ hybridisatie om de lncRNA’s te lokaliseren de menselijke osteosarcoomcellen.
Abstract
De belangrijke rol van lange niet-coderende RNA’s (lncRNA’s) bij kanker is bestudeerd, zoals het reguleren van de proliferatie, epitheliale-mesenchymale overgang (EMT), migratie, infiltratie en autofagie van kankercellen. Lokalisatiedetectie van lncRNA’s in cellen kan inzicht geven in hun functies. Door het ontwerpen van de lncRNA-specifieke antisense-ketensequentie gevolgd door labeling met fluorescerende kleurstoffen, kan RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) worden toegepast om de cellulaire lokalisatie van lncRNA’s te detecteren. Samen met de ontwikkeling van microscopie maken de RNA FISH-technieken het nu zelfs mogelijk om de slecht tot expressie gebrachte lncRNA’s te visualiseren. Deze methode kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA’s alleen detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA’s, DNA of eiwitten detecteren door gebruik te maken van tweekleurige of meerkleurige immunofluorescentie. Hier hebben we de gedetailleerde experimentele werkingsprocedure en voorzorgsmaatregelen van RNA FISH opgenomen door lncRNA small nucleolar RNA host gen 6 (SNHG6) in menselijke osteosarcoomcellen (143B) als voorbeeld te gebruiken, om een referentie te bieden voor onderzoekers die RNA FISH-experimenten willen uitvoeren, met name lncRNA FISH.
Introduction
Ons begrip van het menselijk genoom is sterk uitgebreid door recente ontwikkelingen in de technologie van het hele genoom. Ongeveer 93% van het menselijk genoom kan worden getranscribeerd in RNA’s, maar slechts 2% van de RNA’s kan worden vertaald in eiwitten; de overige 98% van de RNA’s die geen eiwittranslatiefunctie hebben, worden niet-coderend RNA (ncRNA) genoemd1. Als klasse van niet-coderende RNA’s (ncRNA’s) hebben lange ncRNA’s (lncRNA’s), die meer dan 200 nucleotiden bevatten, steeds meer aandacht getrokken vanwege hun betrokkenheid bij vele fysiologische en pathologische processen van de cellen, zoals differentiatie, cycluscontrole, apoptose, migratie en invasie 3,4,5. LncRNA’s spelen hun rol via verschillende mechanismen, zoals het reguleren van de chromatinestructuur en nucleaire genexpressie, het beheersen van het mRNA-splitsingsproces en posttranscriptionele modificatie6. LncRNA’s reguleren het optreden, de ontwikkeling en de metastase van maligniteiten op zowel transcriptioneel als posttranscriptioneel niveau. Transcriptionele regulatie wordt gerealiseerd in de kern door RNA-transcriptie te beïnvloeden via binding aan de chromosomale structuren, terwijl posttranscriptionele regulatie wordt gerealiseerd in het cytoplasma door de doelgenen te controleren via een endogene competitieve RNA (ceRNA) –mechanisme 5,7,8. CeRNA heeft een nieuw mechanisme van RNA-interactie onthuld, namelijk dat lncRNA’s kunnen fungeren als een spons om miRNA’s te adsorberen en de miRNA-gemedieerde afbraak van verwante doelgenen teremmen. Daarom is de informatie over de subcellulaire lokalisatie van lncRNA’s, of een specifiek lncRNA zich nu in het cytoplasma of de kern bevindt, belangrijk om hun biologische functies te helpen identificeren.
Op dit moment wordt lncRNA-lokalisatie voornamelijk gedetecteerd door twee methoden, de ene is door middel van een nucleus/cytoplasmafractie-isolatietest en de andere is door RNA FISH. In het eerste geval worden RNA’s in respectievelijk de cytoplasmatische en de nucleaire fracties geëxtraheerd, en vervolgens wordt PCR-amplificatie uitgevoerd met specifieke lncRNA-primers om de verhouding van lncRNA’s in het cytoplasma en de kern te detecteren. Het voordeel van deze methode is tijdsefficiëntie, terwijl het nadeel is dat de werkelijke lncRNA-lokalisatie niet direct wordt weerspiegeld door het relatieve aandeel lncRNA’s in het cytoplasma en de kern. RNA FISH kan lncRNA-lokalisatie in cellen detecteren door het ontwerp van lncRNA-specifieke antisense-ketensequenties, gevolgd door labeling met fluorescerende kleurstoffen10. De RNA FISH-methoden zijn verbeterd met vooruitgang in sondetechnieken en detectiemethoden, waaronder fluorofoor-gelabelde meervoudige oligo-sondesets11, LNA-sondes12 en vertakte DNA-sondes (bDNA)13. RNA FISH kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA’s, DNA of eiwitten detecteren door gebruik te maken van tweekleurige of meerkleurige immunofluorescentie14.
In dit werk hebben we het gedetailleerde intracellulaire lokalisatiedetectieprotocol van lncRNA klein nucleolair RNA-gastheergen 6 (SNHG6) in osteosarcoomcellen (143B) door RNA FISH als voorbeeld opgenomen. SNHG6 is een 600-730 nucleotide lncRNA in zijn volwassen gesplitste vorm en geïdentificeerd als een nieuw oncogen bij diverse menselijke kankers, waaronder colorectale kanker, maagkanker, ovariumcarcinoom, osteosarcoom en hepatocellulair carcinoom15,16,17,18. Studies hebben de betrokkenheid van SNHG6 bij biologisch gedrag van kankercellen bevestigd, zoals proliferatie, EMT en autofagie, en hebben de cytoplasmatische lokalisatie van SNHG6 aangetoond waar het de doelgenen kan beïnvloeden door de miRNA’s te binden (sponsen)15,16,17. Dit gedetailleerde detectieprotocol van SNHG6 intracellulaire lokalisatie door RNA FISH wordt hierin gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit RNA FISH-protocol kan niet alleen de lokalisatie van lncRNA’s in cellen detecteren, maar ook de colokalisatie van andere RNA’s, DNA of eiwitten in cellen, die ook kunnen worden gebruikt om de locatie van lncRNA’s in in paraffine ingebedde weefsels te detecteren. Het specifieke protocol in dergelijke gevallen is echter anders omdat de in paraffine ingebedde weefsels van was moeten worden ontdaan21. Deze experimentele procedure kan worden toegepast in platen met 48 of 96 putjes, maar platen met …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van (1) het National Key R&D-programma van China (2020YFE0201600); (2) de National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Onderzoeksprojecten binnen het budget van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
Referências
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
