RNA-fluorescens in situ-hybridisering for lang, ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller

Summary

Den foreliggende protokollen beskriver en metode for RNA-fluorescens in situ-hybridisering for å lokalisere lncRNAene i humane osteosarkomceller.

Abstract

De viktige rollene til lange ikke-kodende RNA (lncRNA) i kreft har blitt studert, for eksempel regulering av spredning, epitel-mesenkymal overgang (EMT), migrasjon, infiltrasjon og autofagi av kreftceller. Lokaliseringsdeteksjon av lncRNA i celler kan gi innsikt i deres funksjoner. Ved å designe den lncRNA-spesifikke antisensekjedesekvensen etterfulgt av merking med fluorescerende fargestoffer, kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) påføres for å oppdage den cellulære lokaliseringen av lncRNAer. Sammen med utviklingen av mikroskopi tillater RNA FISH-teknikkene nå til og med visualisering av de dårlig uttrykte lncRNAene. Denne metoden kan ikke bare oppdage lokalisering av lncRNA alene, men også oppdage samlokalisering av andre RNAer, DNA eller proteiner ved å bruke dobbeltfarget eller flerfarget immunfluorescens. Her har vi inkludert den detaljerte eksperimentelle operasjonsprosedyren og forholdsregler for RNA FISH ved å bruke lncRNA lite nukleolært RNA-vertsgen 6 (SNHG6) i humane osteosarkomceller (143B) som et eksempel, for å gi en referanse for forskere som ønsker å utføre RNA FISH-eksperimenter, spesielt lncRNA FISH.

Introduction

Vår forståelse av det menneskelige genom har blitt sterkt utvidet av de siste fremskrittene innen helgenomteknologi. Omtrent 93% av det menneskelige genom kan transkriberes til RNA, men bare 2% av RNAene kan oversettes til proteiner; de resterende 98% av RNA som ikke har noen proteinoversettelsesfunksjon kalles ikke-kodende RNA (ncRNA)¹. Som en klasse av ikke-kodende RNA (ncRNAer), har lange ncRNA (lncRNAer), som inneholder over 200 nukleotider², tiltrukket seg økende oppmerksomhet på grunn av deres involvering i mange fysiologiske og patologiske prosesser i cellene, som differensiering, sykluskontroll, apoptose, migrasjon og invasjon ^3,4,5. LncRNA spiller sine roller gjennom ulike mekanismer, for eksempel regulering av kromatinstruktur og nukleært genuttrykk, kontroll av mRNA-skjøteprosessen og posttranskripsjonell modifikasjon⁶. LncRNA regulerer forekomst, utvikling og metastase av maligniteter både på transkripsjons- og posttranskripsjonsnivå. Transkripsjonsregulering realiseres i kjernen ved å påvirke RNA-transkripsjon via binding til kromosomale strukturer, mens posttranskripsjonell regulering realiseres i cytoplasma ved å kontrollere målgenene via en endogen konkurransedyktig RNA (ceRNA) mekanisme ^5,7,8. CeRNA har avslørt en ny mekanisme for RNA-interaksjon, nemlig at lncRNA kan fungere som en svamp for å adsorbere miRNA og hemme miRNA-mediert nedbrytning av relaterte målgener⁹. Derfor er informasjonen om subcellulær lokalisering av lncRNAer, om et spesifikt lncRNA er lokalisert i cytoplasma eller kjerne, viktig for å identifisere deres biologiske funksjoner.

For tiden oppdages lncRNA-lokalisering hovedsakelig ved to metoder, den ene er ved kjerne / cytoplasmafraksjonsisolasjonsanalyse, og den andre er av RNA FISH. I førstnevnte ekstraheres RNA i henholdsvis cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner, og deretter utføres PCR-amplifikasjon med spesifikke lncRNA-primere for å oppdage forholdet mellom lncRNA i cytoplasma og kjerne. Fordelen med denne metoden er tidseffektivitet, mens ulempen er at den faktiske lncRNA-lokaliseringen ikke direkte reflekteres av den relative andelen lncRNA i cytoplasma og kjerne. RNA FISH kan oppdage lncRNA-lokalisering i celler gjennom design av lncRNA-spesifikke antisense-kjedesekvenser etterfulgt av merking med fluorescerende fargestoffer¹⁰. RNA FISH-metodene har blitt forbedret med fremskritt innen sondeteknikker og deteksjonsmetoder, inkludert fluoroformerkede flere oligoprobesett¹¹, LNA-prober 12 og forgrenede DNA (bDNA) sonder¹³. RNA FISH kan ikke bare oppdage lokalisering av lncRNA, men også oppdage samlokalisering av andre RNA, DNA eller proteiner ved å bruke dobbeltfarget eller flerfarget immunfluorescens¹⁴.

I dette arbeidet har vi inkludert den detaljerte intracellulære lokaliseringsdeteksjonsprotokollen for lncRNA lite nukleolært RNA-vertsgen 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) av RNA FISH som et eksempel. SNHG6 er et 600-730 nukleotid lncRNA i sin modne skjøteform og identifisert som et nytt onkogen i forskjellige humane kreftformer, inkludert kolorektal kreft, magekreft, ovarieklarcellet karsinom, osteosarkom og hepatocellulært karsinom^15,16,17,18. Studier har bekreftet involvering av SNHG6 i biologisk oppførsel av kreftceller, som proliferasjon, EMT og autofagi, og vist cytoplasmatisk lokalisering av SNHG6 der det kan påvirke målgenene ved å binde (svampe) miRNAene^15,16,17. Denne detaljerte deteksjonsprotokollen for SNHG6 intracellulær lokalisering av RNA FISH er presentert her.

Protocol

Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen. Figur 1 viser den overordnede protokollen for RNA FISH; Tabell 1 inneholder sammensetningen av alle oppløsninger og tabell 2 inneholder primersekvensene som brukes i denne protokollen. 1. Forberedelse av sonde Identifiser og skaff deg FASTA-sekvensen av et mål lncRNA av in…

Representative Results

Representative bilder av SNHG6 FISH i humane osteosarkomceller er vist (figur 2). Den negative kontrollen behandles med den negative Ctrl-sonden; positiv kontroll behandles med U6-sonde 20. SNHG6-sonden og U6-sonden er merket med Cy3, som avgir rød fluorescens. DAPI er et fargestoff som flekker DNA, som avgir blå fluorescens. Dette resultatet viser at SNHG6 hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma, og denne informasjonen kan gi en viktig retning for videre studier av…

Discussion

Denne RNA FISH-protokollen kan ikke bare oppdage lokalisering av lncRNA i celler, men også oppdage samlokalisering av andre RNAer, DNA eller proteiner i celler, som også kan brukes til å oppdage plasseringen av lncRNA i parafin-innebygd vev. Den spesifikke protokollen i slike tilfeller er imidlertid annerledes fordi det parafininnebygde vevet må avvoks²¹. Denne eksperimentelle prosedyren kan brukes i 48- eller 96-brønnsplater, men 384-brønnplater er for små til å brukes her.

<p class="…

Materials

Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent