RGBradford: Количественное определение белка с помощью камеры смартфона

Summary

В данной статье представлен протокол количественного определения белка с использованием анализа Брэдфорда и смартфона в качестве аналитического устройства. Уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.

Abstract

Количественное определение белка является важной процедурой в медико-биологических исследованиях. Среди нескольких других методов анализ Брэдфорда является одним из наиболее часто используемых. Из-за его широкого распространения, ограничения и преимущества анализа Брэдфорда были исчерпывающе описаны, включая несколько модификаций оригинального метода для улучшения его характеристик. Одной из переделок оригинального метода является использование камеры смартфона в качестве аналитического инструмента. Используя преимущества трех форм красителя Coomassie Brilliant Blue, которые существуют в условиях анализа Брэдфорда, в этой статье описывается, как точно количественно определить белок в образцах, используя данные о цвете, извлеченные из одного изображения микропланшета. После проведения анализа на микропланшете с помощью камеры смартфона делается снимок, а цветовые данные RGB извлекаются из изображения с помощью бесплатного программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом. Затем отношение интенсивности синего и зеленого (по шкале RGB) образцов с неизвестными концентрациями белка используется для расчета содержания белка на основе стандартной кривой. Существенной разницы между значениями, рассчитанными с использованием цветовых данных RGB, и значениями, рассчитанными с использованием обычных данных поглощения, не наблюдается.

Introduction

Независимо от последующего использования (например, ИФА, кинетика ферментов, вестерн-блоттинг, очистка белков и масс-спектрометрия), количественное определение белка имеет решающее значение для точного анализа в лабораториях медико-биологических наук. В дополнение к их использованию в качестве вторичных индикаторов (т.е. для вычисления относительных уровней аналитов на массу белка), уровни белка в образце также могут быть желаемым результатом. Например, можно интересоваться уровнем белка в пищевых ресурсах¹ или в моче². Существует множество методов измерения концентрации белка в образцах³, в том числе прямые показания поглощения УФ-излучения⁴, хелатирование белка и меди ^5,6, колориметрические анализы^{связывания} белка с красителем 7 и флуоресцентные анализы⁸, связывающие белки с красителями. Об актуальности количественного определения белка свидетельствует наличие в топ-3 наиболее цитируемой литературы^двух работ, описывающих методы измерения белка ^{5,7 9,10}. Несмотря на то, что многие авторы пренебрегают фактическим цитированием, ссылаясь на непервичные ссылки или вообще ничего не цитируя, оригинальные статьи, описывающие белковый анализ Лоури и белковый анализ Брэдфорда, насчитывают >200 000 цитирований^каждая.

Популярность теста Брэдфорда обусловлена его доступностью, простотой, скоростью и чувствительностью. Анализ основан на взаимодействии между белками и красителем Coomassie Brilliant Blue G в кислых условиях. В условиях анализа (т.е. при низком рН) краситель существует в трех формах: красная катионная форма с λmax при 470 нм; зеленая нейтральная форма с λmax на длине волны 650 нм; и синяя анионная форма с λmax при 590 нм ^11,12 (рис. 1). Катионная форма преобладает при отсутствии белков. По мере того, как белки взаимодействуют с красителем, они стабилизируют синюю анионную форму, вызывая заметное изменение цвета раствора, от коричневатого до синего. Обычно изменение концентрации синей формы красителя количественно оценивают спектрофотометрически, поглощение которой при 590-595 нм пропорционально количеству белка в анализе.

Рисунок 1: Спектры поглощения G бриллиантового синего цвета Кумасси в условиях Брэдфордского анализа. Три основных пика отмечены стрелками, указывающими λmax красной (470 нм), зеленой (650 нм) и синей (590 нм) форм красителя. Спектры регистрировали в отсутствие белка (желтая линия) и в присутствии 3 мкг (серая линия) и 10 мкг (синяя линия) бычьего сывороточного альбумина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Широкое использование анализа Брэдфорда привело к выявлению ряда ограничений (например, вариабельная реакция на различные белки¹¹ и интерференция липидов¹³ и детергентов⁷) и разработке модификаций для улучшения его характеристик (например, добавление детергентов^14,15, подщелачивание^14,16 и использование коэффициента абсорбции¹⁷). В дополнение к модификациям в самом анализе, также было описано использование альтернативных устройств, таких как смартфоны или камеры, для захвата аналитических сигналов ^18,19,20. Действительно, разработка методов, использующих смартфоны в качестве портативных химических анализаторов, была активной областью исследований. Мотивация использования смартфонов проистекает из доступности, портативности, простоты использования и широкой доступности этих устройств.

В данной работе представлен протокол количественного определения белка с использованием теста RGBradford²⁰, в котором в качестве аналитического устройства используется смартфон. В отличие от оригинальной публикации RGBradford²⁰, здесь была введена процедура, которая упрощает процесс извлечения цвета. Он включает в себя использование свободно доступного программного приложения для автоматического извлечения информации о цвете из каждой лунки изображения на микропластине, что значительно экономит время и усилия. Это альтернатива предыдущему методу ручного получения цветовых данных из каждой скважины по отдельности с помощью графического редактора²⁰. В конечном счете, уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.

Protocol

1. Приготовление реагента для белкового анализа Брэдфорда Растворите 100 мг Coomassie Brilliant Blue G в 50 мл 95% (по массе) этанола. Перемешивайте до полного растворения Coomassie Brilliant Blue G.ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и вызывает раздражение глаз. Избегайте пламени и используйте ?…

Representative Results

На рисунке 4 изображена микропластина, из которой были извлечены цветовые данные, и записано поглощение на длинах волн 450 нм и 590 нм. Данные о цвете RGB, представленные здесь в качестве репрезентативных, были получены автоматически, как описано в разделе 5. Типичным паттерно…

Discussion

В этой статье описывается RGBradford, метод, который использует камеру смартфона для записи данных анализа белка в Брэдфорде, извлечения цветовых данных и точного количественного определения уровня белка в биологических образцах, как первоначально было описано^{недавно}. Одно и?…

Materials

96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.