RGBradford: Proteinkvantificering med et smartphone-kamera

Summary

Dette papir giver en protokol til proteinkvantificering ved hjælp af Bradford-analysen og en smartphone som analytisk enhed. Proteinniveauer i prøver kan kvantificeres ved hjælp af farvedata ekstraheret fra et billede af en mikroplade taget med en smartphone.

Abstract

Proteinkvantificering er en vigtig procedure inden for biovidenskabelig forskning. Blandt flere andre metoder er Bradford-analysen en af de mest anvendte. På grund af dets udbredelse er begrænsningerne og fordelene ved Bradford-analysen blevet udtømmende rapporteret, herunder flere ændringer af den oprindelige metode for at forbedre dens ydeevne. En af ændringerne i den oprindelige metode er brugen af et smartphone-kamera som et analytisk instrument. Ved at udnytte de tre former for Coomassie Brilliant Blue-farvestoffet, der findes under betingelserne i Bradford-analysen, beskriver dette papir, hvordan man nøjagtigt kvantificerer protein i prøver ved hjælp af farvedata ekstraheret fra et enkelt billede af en mikroplade. Efter udførelse af analysen i en mikroplade tages et billede ved hjælp af et smartphone-kamera, og RGB-farvedata ekstraheres fra billedet ved hjælp af en gratis og open source billedanalysesoftwareapplikation. Derefter bruges forholdet mellem blå og grøn intensitet (i RGB-skalaen) af prøver med ukendte koncentrationer af protein til at beregne proteinindholdet baseret på en standardkurve. Der observeres ingen signifikant forskel mellem værdier beregnet ved hjælp af RGB-farvedata og dem, der beregnes ved hjælp af konventionelle absorbansdata.

Introduction

Uanset downstream-brugen (f.eks. ELISA, enzymkinetik, western blotting, proteinoprensning og massespektrometri) er proteinkvantificering afgørende for nøjagtig analyse i biovidenskabelige laboratorier. Ud over deres anvendelse som sekundære aflæsninger (dvs. til beregning af relative niveauer af analysander pr. Masse protein) kan proteinniveauer i en prøve også være det ønskede output selv. For eksempel kan man være interesseret i proteinniveauer i fødevareressourcer¹ eller i urin². Der findes mange metoder til måling af proteinkoncentration i prøver³, herunder direkte UV-absorbansaflæsninger⁴, protein-kobberchelation ^5,6, proteinfarvestofbindende kolorimetriske assays⁷ og proteinfarvestofbindende fluorescerende assays⁸. Relevansen af proteinkvantificering fremgår af tilstedeværelsen af to artikler, der beskriver proteinmålemetoder ^5,7 i top-3 i den mest citerede litteratur ^9,10. På trods af at mange forfattere forsømmer deres faktiske citat ved at citere ikke-primære referencer eller slet ikke citere noget, udgør de originale papirer, der beskriver Lowry-proteinanalysen og Bradford-proteinanalysen, > 200.000 citationer hver¹⁰.

Populariteten af Bradford-analysen stammer fra dens overkommelighed, enkelhed, hastighed og følsomhed. Analysen er baseret på interaktionen mellem proteiner og farvestoffet Coomassie Brilliant Blue G under sure forhold. Under betingelserne for analysen (dvs. lav pH) findes farvestoffet i tre former: en rød kationisk form med λmax ved 470 nm; en grøn neutral form med λmax ved 650 nm; og en blå anionisk form med λmax ved 590 nm^11,12 (figur 1). Den kationiske form dominerer i fravær af proteiner. Når proteiner interagerer med farvestoffet, stabiliserer de den blå anioniske form, hvilket forårsager en mærkbar ændring i opløsningens farve, fra brunlig til blå. Normalt kvantificeres ændringen i koncentrationen af farvestoffets blå form specrophotometrisk, hvis absorbans ved 590-595 nm er proportional med mængden af protein i analysen.

Figur 1: Coomassie brilliant blue G-absorptionsspektre under Bradford-assayets betingelser. De tre hovedtoppe er markeret med pile, der angiver λmax for de røde (470 nm), grønne (650 nm) og blå (590 nm) former af farvestoffet. Spektre blev registreret i fravær af protein (gul linje) og i nærværelse af 3 μg (grå linje) og 10 μg (blå linje) bovint serumalbumin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den udbredte anvendelse af Bradford-analysen har ført til identifikation af flere begrænsninger (f.eks. variable reaktioner på forskellige proteiner¹¹ og interferens fra lipider¹³ og vaskemidler⁷) og udvikling af modifikationer for at forbedre dets ydeevne (f.eks. tilsætning af vaskemidler^14,15, alkalisering^14,16 og anvendelse af forholdet mellem absorbanser¹⁷). Ud over ændringer i selve analysen er brugen af alternative enheder, såsom smartphones eller kameraer, til at fange analytiske signaler også blevet beskrevet 18,19,20. Faktisk har udviklingen af metoder, der gør brug af smartphones som bærbare kemiske analysatorer, været et aktivt forskningsområde. Motivationen for brugen af smartphones stammer fra overkommeligheden, bærbarheden, brugervenligheden og den udbredte tilgængelighed af disse enheder.

Dette papir giver en protokol til proteinkvantificering ved hjælp af RGBradford-assay²⁰, der bruger en smartphone som analytisk enhed. I modsætning til den originale RGBradford-publikation²⁰ er der her indført en procedure, der strømliner farveudtrækningsprocessen. Det indebærer brug af en frit tilgængelig softwareapplikation til automatisk at udtrække farveinformation fra hver brønd i et mikropladebillede, hvilket sparer betydelig tid og kræfter. Dette er et alternativ til den tidligere metode til manuelt at erhverve farvedata fra hver brønd en efter en ved hjælp af en grafikredigeringssoftwareapplikation²⁰. I sidste ende kan proteinniveauer i prøver kvantificeres ved hjælp af farvedata ekstraheret fra et billede af en mikroplade taget med en smartphone.

Protocol

1. Fremstilling af Bradford-proteinassayreagenset 100 mg Coomassie Brilliant Blue G opløses i 50 ml 95% (w/v) ethanol. Bland indtil Coomassie Brilliant Blue G er helt opløst.FORSIGTIG: Ethanol er brandfarligt og forårsager øjenirritation. Undgå flammer og brug beskyttelsesbriller. Til den forrige opløsning tilsættes forsigtigt 100 ml 85% (w/v) fosforsyre.FORSIGTIG: Fosforsyre er ætsende for metaller og forårsager hudætsning, alvorlig øjenskade og akut oral toksicite…

Representative Results

Figur 4 er et billede af en mikroplade, hvorfra farvedata blev ekstraheret, og absorbans ved 450 nm og 590 nm blev registreret. RGB-farvedataene, der her rapporteres som repræsentative, blev indhentet automatisk som beskrevet i afsnit 5. Et typisk mønster af farvedata er en stigning i de blå værdier og et fald i de røde og grønne værdier (figur 5). Bemærk, at på trods af den tydelige refleksion i alle brønde og en ikke perfekt justeret mikroplade (<str…

Discussion

Dette papir beskriver RGBradford, en metode, der bruger et smartphone-kamera til at registrere data fra et Bradford-proteinassay, ekstrahere farvedata og nøjagtigt kvantificere proteinniveauer i biologiske prøver som oprindeligt beskrevet for nylig²⁰. En forskel fra den originale RGBradford-metode er, at her blev der brugt en procedure til automatisk hentning af farvedata med et ImageJ-plugin²² . Den vigtigste nyhed ved RGBradford-metoden er brugen af RGB-data som analyti…

Materials

96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.