RGBradford : Quantification des protéines avec l’appareil photo d’un smartphone

Summary

Cet article fournit un protocole pour la quantification des protéines à l’aide du test de Bradford et d’un smartphone comme dispositif d’analyse. Les niveaux de protéines dans les échantillons peuvent être quantifiés à l’aide de données de couleur extraites d’une photo d’une microplaque prise avec un smartphone.

Abstract

La quantification des protéines est une procédure essentielle dans la recherche en sciences de la vie. Parmi plusieurs autres méthodes, le test Bradford est l’une des plus utilisées. En raison de sa grande popularité, les limites et les avantages du test Bradford ont été rapportés de manière exhaustive, y compris plusieurs modifications de la méthode originale pour améliorer ses performances. L’une des modifications de la méthode originale est l’utilisation de l’appareil photo d’un smartphone comme instrument d’analyse. En tirant parti des trois formes du colorant bleu brillant de Coomassie qui existent dans les conditions du test de Bradford, cet article décrit comment quantifier avec précision les protéines dans les échantillons à l’aide de données de couleur extraites d’une seule image d’une microplaque. Après avoir effectué le test dans une microplaque, une image est prise à l’aide de l’appareil photo d’un smartphone et les données de couleur RVB sont extraites de l’image à l’aide d’une application logicielle d’analyse d’image gratuite et open-source. Ensuite, le rapport entre l’intensité bleue et l’intensité verte (dans l’échelle RVB) d’échantillons avec des concentrations inconnues de protéines est utilisé pour calculer la teneur en protéines sur la base d’une courbe standard. Aucune différence significative n’est observée entre les valeurs calculées à l’aide des données de couleur RVB et celles calculées à l’aide des données d’absorbance conventionnelles.

Introduction

Quelle que soit l’utilisation en aval (par exemple, ELISA, cinétique enzymatique, transfert Western, purification des protéines et spectrométrie de masse), la quantification des protéines est cruciale pour une analyse précise dans les laboratoires des sciences de la vie. En plus de leur utilisation comme lectures secondaires (c’est-à-dire pour calculer les niveaux relatifs d’analytes par masse de protéines), les niveaux de protéines dans un échantillon peuvent également être le résultat souhaité lui-même. Par exemple, on peut s’intéresser aux teneurs en protéines des ressources alimentaires¹ ou dans l’urine². Il existe de nombreuses méthodes disponibles pour mesurer la concentration de protéines dans les échantillons³, y compris les lectures directes d’absorbance UV⁴, la chélation protéine-cuivre ^5,6, les tests colorimétriques de liaison protéine-colorant⁷ et les tests fluorescents de liaison protéine-colorant⁸. La pertinence de la quantification des protéines est mise en évidence par la présence de deux articles décrivant les méthodes de mesure des protéines ^5,7 dans le top-3 de la littérature la plus citée ^9,10. Malgré le fait que de nombreux auteurs négligent leur citation réelle en citant des références non primaires ou en ne citant rien du tout, les articles originaux décrivant le test protéique de Lowry et le test protéique de Bradford s’élèvent > 200 000 citations chacun^{des 10}.

La popularité du test Bradford découle de son prix abordable, de sa simplicité, de sa rapidité et de sa sensibilité. Le test est basé sur l’interaction entre les protéines et le colorant Coomassie Brilliant Blue G dans des conditions acides. Dans les conditions de l’essai (c’est-à-dire un pH bas), le colorant existe sous trois formes : une forme cationique rouge avec λmax à 470 nm ; une forme neutre verte avec λmax à 650 nm ; et une forme anionique bleue avec λmax à 590 nm^11,12 (Figure 1). La forme cationique prédomine en l’absence de protéines. Au fur et à mesure que les protéines interagissent avec le colorant, elles stabilisent la forme anionique bleue, provoquant un changement notable de la couleur de la solution, de brunâtre à bleu. Habituellement, le changement de concentration de la forme bleue du colorant est quantifié par spectrophotométrie, dont l’absorbance à 590-595 nm est proportionnelle à la quantité de protéines dans le test.

Figure 1 : Spectres d’absorption G bleu brillant de Coomassie dans les conditions de l’essai de Bradford. Les trois pics principaux sont marqués par des flèches indiquant le λmax des formes rouge (470 nm), verte (650 nm) et bleue (590 nm) du colorant. Les spectres ont été enregistrés en l’absence de protéines (raie jaune) et en présence de 3 μg (raie grise) et 10 μg (raie bleue) d’albumine sérique bovine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’utilisation généralisée du test de Bradford a conduit à l’identification de plusieurs limites (par exemple, des réponses variables à différentes protéines¹¹ et à l’interférence des lipides¹³ et des détergents⁷) et à la mise au point de modifications pour améliorer ses performances (par exemple, l’ajout de détergents^14,15, l’alcalinisation^14,16 et l’utilisation du rapport d’absorbances¹⁷). En plus des modifications apportées au test lui-même, l’utilisation d’appareils alternatifs, tels que des smartphones ou des appareils photo, pour capturer des signaux analytiques a également été décrite 18,19,20. En effet, le développement de méthodes qui utilisent les smartphones comme analyseurs chimiques portables a été un domaine de recherche actif. La motivation pour l’utilisation des smartphones découle de l’abordabilité, de la portabilité, de la facilité d’utilisation et de la disponibilité généralisée de ces appareils.

Cet article fournit un protocole pour la quantification des protéines à l’aide du test RGBradford²⁰, qui utilise un smartphone comme dispositif d’analyse. Contrairement à la publication originale RGBradford²⁰, ici, une procédure qui rationalise le processus d’extraction des couleurs a été introduite. Il s’agit de l’utilisation d’une application logicielle disponible gratuitement pour extraire automatiquement les informations de couleur de chaque puits d’une image de microplaque, ce qui permet d’économiser beaucoup de temps et d’efforts. Il s’agit d’une alternative à la méthode précédente consistant à acquérir manuellement les données de couleur de chaque puits un par un à l’aide d’un logiciel d’édition graphique²⁰. En fin de compte, les niveaux de protéines dans les échantillons peuvent être quantifiés à l’aide de données de couleur extraites d’une photo d’une microplaque prise avec un smartphone.

Protocol

1. Préparation du réactif de dosage des protéines de Bradford Dissoudre 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G dans 50 ml d’éthanol à 95 % (p/v). Mélanger jusqu’à ce que Coomassie Brilliant Blue G soit complètement dissous.ATTENTION : L’éthanol est inflammable et provoque une irritation des yeux. Évitez les flammes et utilisez des lunettes de protection. Ajouter 100 mL d’acide phosphorique à 85 % (p/v) à la solution précédente.ATTENTION : L’acide phospho…

Representative Results

La figure 4 est une image d’une microplaque à partir de laquelle les données de couleur ont été extraites et l’absorbance à 450 nm et 590 nm a été enregistrée. Les données de couleur RVB rapportées ici comme représentatives ont été obtenues automatiquement comme décrit dans la section 5. Un modèle typique des données de couleur est une augmentation des valeurs bleues et une diminution des valeurs rouges et vertes (Figure 5). Il est à noter q…

Discussion

Cet article décrit RGBradford, une méthode qui utilise l’appareil photo d’un smartphone pour enregistrer les données d’un test de protéine Bradford, extraire les données de couleur et quantifier avec précision les niveaux de protéines dans les échantillons biologiques, comme décrit récemment²⁰. Une différence par rapport à la méthode RGBradford originale est qu’ici une procédure permettant d’obtenir automatiquement des données de couleur avec un plugin ImageJ<sup class="xr…

Materials

96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.