यह प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर विज़ुअलाइज़ेशन और उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के प्रसार, भेदभाव और धुंधलापन के लिए एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है।
माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में कई आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें ऊर्जा उत्पादन, सीए2 + होमियोस्टैसिस का विनियमन, लिपिड जैवसंश्लेषण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन शामिल है। ये माइटोकॉन्ड्रिया-मध्यस्थता प्रक्रियाएं न्यूरॉन्स में विशेष भूमिका निभाती हैं, इन कोशिकाओं की उच्च ऊर्जा मांगों को पूरा करने के लिए एरोबिक चयापचय का समन्वय करती हैं, सीए2 + सिग्नलिंग को संशोधित करती हैं, अक्षतंतु विकास और पुनर्जनन के लिए लिपिड प्रदान करती हैं, और न्यूरोनल विकास और कार्य के लिए आरओएस उत्पादन को ट्यून करती हैं। इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में एक केंद्रीय चालक है। माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और कार्य अटूट रूप से जुड़े हुए हैं। क्रिस्टे नामक संरचनात्मक परतों के साथ रूपात्मक रूप से जटिल आंतरिक झिल्ली कई आणविक प्रणालियों को आश्रय देती है जो माइटोकॉन्ड्रियन की हस्ताक्षर प्रक्रियाओं को निष्पादित करती हैं। आंतरिक झिल्ली की वास्तुशिल्प विशेषताएं अल्ट्रास्ट्रक्चरल हैं और इसलिए, पारंपरिक विवर्तन-सीमित हल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर पर अधिकांश अंतर्दृष्टि निश्चित नमूनों पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से आई है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में उभरती प्रौद्योगिकियां अब दसियों नैनोमीटर तक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती हैं, जिससे लाइव कोशिकाओं में अल्ट्रास्ट्रक्चरल सुविधाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल संरचना, नैनोस्केल प्रोटीन वितरण और क्रिस्टे गतिशीलता के ठीक विवरण ों को सीधे चित्रित करने की एक अभूतपूर्व क्षमता प्रदान करता है, जो मौलिक नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो माइटोकॉन्ड्रिया को मानव स्वास्थ्य और बीमारी से जोड़ता है। यह प्रोटोकॉल जीवित मानव न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने के लिए उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के उपयोग को प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया को पांच वर्गों में व्यवस्थित किया जाता है: (1) एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन का विकास और भेदभाव, (2) प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का अलगाव, चढ़ाना और विकास, (3) लाइव एसटीईडी इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को धुंधला करने की प्रक्रियाएं, (4) संदर्भ के लिए एसटीईडी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लाइव सेल एसटीईडी प्रयोगों के लिए प्रक्रियाएं, और (5) आंतरिक झिल्ली की रूपात्मक विशेषताओं को मापने और मापने के लिए उदाहरणों का उपयोग करके विभाजन और छवि प्रसंस्करण के लिए मार्गदर्शन।
माइटोकॉन्ड्रिया एंडोसिम्बायोटिक मूल के यूकेरियोटिक ऑर्गेनेल हैं जो मध्यस्थ चयापचय और एटीपी उत्पादन, आयन होमियोस्टैसिस, लिपिड बायोसिंथेसिस और प्रोग्राम्ड सेल डेथ (एपोप्टोसिस) सहित कई प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हैं। ये ऑर्गेनेल टोपोलॉजिकल रूप से जटिल होते हैं, जिसमें एक डबल झिल्ली प्रणाली होती है जो कई सबकम्पार्टमेंट 1 (चित्रा 1 ए) स्थापित करती है। बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (ओएमएम) साइटोसोल के साथ इंटरफेस करती है और प्रत्यक्ष अंतर-ऑर्गेनेल संपर्क 2,3 स्थापित करती है। आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) एक ऊर्जा-संरक्षण झिल्ली है जो मुख्य रूप से एटीपी संश्लेषण और अन्य ऊर्जा-आवश्यकप्रक्रियाओं को चलाने के लिए एक विद्युत झिल्ली क्षमता (त्रिभुजएम) के रूप में संग्रहीत आयन ग्रेडिएंट को बनाए रखती है। आईएमएम को आगे आंतरिक सीमा झिल्ली (आईबीएम) में विभाजित किया गया है, जो ओएमएम से निकटता से जुड़ा हुआ है, और क्रिस्टे नामक उभरी हुई संरचनाएं जो क्रिस्टे झिल्ली (सीएम) से बंधी हुई हैं। यह झिल्ली इंट्राक्रिस्टल स्पेस (आईसीएस) और इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (आईएमएस) से सबसे भीतरी मैट्रिक्स डिब्बे को चित्रित करती है।
माइटोकॉन्ड्रिया में विखंडन और संलयन की निरंतर और संतुलित प्रक्रियाओं के आधार पर एक गतिशील आकृति विज्ञान होता है जो डायनामिन सुपरफैमिली6 के मेकेनोएंजाइम द्वारा नियंत्रित होता है। संलयन बढ़ी हुई कनेक्टिविटी और जालीदार नेटवर्क के गठन की अनुमति देता है, जबकि विखंडन माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन की ओर जाता है और माइटोफैगी7 द्वारा क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने में सक्षम बनाता है। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान ऊतक प्रकार8 और विकासात्मक चरण9 द्वारा भिन्न होता है और कोशिकाओं को ऊर्जावान आवश्यकताओं10,11 और तनाव12 सहित कारकों के अनुकूल होने की अनुमति देने के लिए विनियमित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया की मानक मोर्फोमेट्रिक विशेषताएं, जैसे नेटवर्क गठन की सीमा (परस्पर बनाम खंडित), परिधि, क्षेत्र, मात्रा, लंबाई (पहलू अनुपात), गोलाई, और शाखाओं की डिग्री, मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा और परिमाणित किया जा सकता है क्योंकि इन विशेषताओं के आकार प्रकाश की विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम)13 से अधिक हैं।
क्रिस्टे आर्किटेक्चर माइटोकॉन्ड्रिया की आंतरिक संरचना को परिभाषित करता है (चित्रा 1 बी)। क्रिस्टे आकृति विज्ञान की विविधता को मोटे तौर पर फ्लैट (लैमेलर या डिस्कोइडल) या ट्यूबलर-वेसिकुलर14 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। सभी क्रिस्टे आईबीएम में ट्यूबलर या स्लॉट जैसी संरचनाओं के माध्यम से जुड़ते हैं जिन्हें क्रिस्टे जंक्शन (सीजे) कहा जाता है जो आईएमएस को आईसीएस से और आईबीएम को सीएम15 से अलग करने का काम कर सकते हैं। क्रिस्टे आकृति विज्ञान को आईएमएम के प्रमुख प्रोटीन परिसरों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें (1) माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइट और क्रिस्टे आयोजन प्रणाली (एमआईसीओएस) शामिल है जो सीजे में रहता है और आईएमएम-ओएमएम संपर्कों को स्थिर करता है16, (2) ऑप्टिक एट्रोफी 1 (ओपीए 1) जीटीपेस जो क्रिस्टे रीमॉडेलिंग17,18,19 को नियंत्रित करता है, और (3) एफ1एफओ एटीपी सिंथेस जो क्रिस्टे टिप्स (सीटी) 20 पर स्थिर ओलिगोमेरिक असेंबली बनाता है। 21. इसके अलावा, आईएमएम नॉनबाइलेयर फॉस्फोलिपिड्स फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन और कार्डियोलिपिन में समृद्ध है जो अत्यधिक घुमावदार आईएमएम22 को स्थिर करता है। क्रिस्टे भी गतिशील हैं, विभिन्न स्थितियों के तहत रूपात्मक परिवर्तन ों का प्रदर्शन करते हैं, जैसे कि विभिन्न चयापचय अवस्थाएं 23,24, विभिन्न श्वसन सब्सट्रेट्स 25 के साथ, भुखमरी और ऑक्सीडेटिव तनाव 26,27 के तहत, एपोप्टोसिस 28,29 के साथ, और उम्र बढ़ने के साथ30. हाल ही में यह दिखाया गया है कि क्रिस्टे सेकंड के टाइमस्केल पर प्रमुख रीमॉडेलिंग घटनाओं से गुजर सकता है, जो उनकी गतिशील प्रकृतिको रेखांकित करता है। क्रिस्टे की कई विशेषताओं को परिमाणित किया जा सकता है, जिसमें व्यक्तिगत क्रिस्टे के भीतर संरचनाओं के आयाम (जैसे, सीजे चौड़ाई, क्रिस्टा लंबाई और चौड़ाई) और पैरामीटर शामिल हैं जो व्यक्तिगत क्रिस्टा को अन्य संरचनाओं से संबंधित करते हैं (उदाहरण के लिए, ओएमएम के सापेक्ष इंट्रा-क्रिस्टा स्पेसिंग और क्रिस्टे घटना कोण)। ये मात्रात्मक क्रिस्टे पैरामीटर फ़ंक्शन के साथ सीधा संबंध दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन की सीमा क्रिस्टे की प्रचुरता से सकारात्मक रूप से संबंधित है, जिसे क्रिस्टे घनत्व या क्रिस्टे संख्या के रूप में एक अन्य विशेषता (जैसे, क्रिस्टे प्रति ओएमएम क्षेत्र) 33,34,35 के रूप में सामान्यीकृत किया गया है। क्योंकि आईएमएम आकृति विज्ञान को नैनोस्केल विशेषताओं द्वारा परिभाषित किया गया है, इसमें माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर शामिल है, जिसके लिए इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है जो प्रकाश विवर्तन सीमा से अधिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती हैं। जैसा कि नीचे वर्णित है, ऐसी तकनीकों में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (नैनोस्कोपी) शामिल हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की तंत्रिका और ग्लियल कोशिकाएं विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर निर्भर हैं। औसतन, मस्तिष्क कुल शरीर के वजन का केवल 2% होता है, लेकिन कुल शरीर ग्लूकोज का 25% उपयोग करता है और शरीर की ऑक्सीजन की खपत का 20% हिस्सा होता है, जिससे यह ऊर्जा चयापचय में हानि के लिए कमजोर हो जाताहै। अल्जाइमर रोग (एडी), एम्योट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), हंटिंगटन रोग (एचडी), मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस), और पार्किंसंस रोग (पीडी) सहित प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग (एनडी), आज तक के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किए गए विकृति विज्ञान में से कुछ हैं, इन रोगों के आणविक आधार को समझने से लेकर संभावित चिकित्सीय रोकथाम और हस्तक्षेप की मांग करने तक के अनुसंधान प्रयासों के साथ। एनडी माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) 37 द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम हैंडलिंग 38 और माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड चयापचय39 से उत्पन्न होने वाले ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि के साथ जुड़े हुए हैं। ये शारीरिक परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में उल्लेखनीय दोषों के साथ होते हैं जो एडी 40,41,42,43,44, एएलएस 45,46, एचडी47,48,49, एमएस 50 और पीडी 51,52,53 से जुड़े होते हैं।. इन संरचनात्मक और कार्यात्मक दोषों को जटिल कारण-प्रभाव संबंधों द्वारा जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह देखते हुए कि क्रिस्टे आकृति विज्ञान ओएक्सपीएचओएसएंजाइम 54 को स्थिर करता है, माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस न केवल ईटीसी द्वारा उत्पन्न होते हैं, बल्कि वे उस बुनियादी ढांचे को नुकसान पहुंचाने के लिए भी कार्य करते हैं जिसमें ईटीसी रहता है, एक फीड-फॉरवर्ड आरओएस चक्र को बढ़ावा देता है जो ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए संवेदनशीलता को बढ़ाता है। इसके अलावा, क्रिस्टे विघटन को माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) रिलीज और ऑटोम्यून्यून, चयापचय और उम्र सेसंबंधित विकारों से जुड़े भड़काऊ मार्गों जैसी प्रक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का विश्लेषण एनडी और उनके आणविक आधार की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी), और एक्स-रे टोमोग्राफी, विशेष रूप से क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी सहित क्रिस्टे को देखने के लोकप्रिय तरीकों ने महत्वपूर्ण निष्कर्षों का खुलासा किया है और विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों 56,57,58,59,60 के साथ काम किया है।. ऑर्गेनेलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के बेहतर अवलोकन की दिशा में हालिया प्रगति के बावजूद, ये विधियां अभी भी नमूना निर्धारण की आवश्यकता की चेतावनी के साथ आती हैं और इसलिए, सीधे क्रिस्टे की वास्तविक समय की गतिशीलता को पकड़ नहीं सकती हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, विशेष रूप से संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम), विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम), और उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी के रूप में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के शास्त्रीय तरीकों को बाधित करने वाली विवर्तन सीमा से नीचे रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता वाली संरचनाओं को देखने के लोकप्रिय तरीके बन गए हैं। जब एक्सएम का उपयोग किसी अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक के साथ संयोजन में किया जाता है, तो परिणाम प्रभावशाली होते हैं, लेकिन नमूना को जेल61 में तय और दाग दिया जाना चाहिए। तुलनात्मक रूप से, सिम, पाम / स्टॉर्म, और एसटीईडी सभी को लाइव नमूनों के साथ सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, और नए और आशाजनक रंजक जो आम तौर पर आईएमएम को दाग देते हैं, माइटोकॉन्ड्रिया क्रिस्टी डायनामिक्स 62,63,64,65,66 की लाइव इमेजिंग के लिए एक नया और आसान दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। एसटीईडी इमेजिंग के लिए लाइव रंगों में हालिया प्रगति ने डाई चमक और फोटोस्टेबिलिटी में सुधार किया है, और ये रंजक अपने पूर्ववर्तियों की तुलना में विशिष्टता की उच्च डिग्री पर आईएमएम को लक्षित करते हैं। ये विकास सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ दीर्घकालिक टाइमलैप्स और जेड-स्टैक प्रयोगों के संग्रह की अनुमति देते हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर और गतिशीलता के बेहतर लाइव सेल विश्लेषण के लिए दरवाजा खुलता है।
यहां, एसटीईडी63 का उपयोग करके पीकेमिटो ऑरेंज (पीकेएमओ) डाई से सना अविभाजित और विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान किए गए हैं। एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन माता-पिता की सेल लाइन, एसके-एन-एसएच से तीन बार उपक्लोन व्युत्पन्न है, जो मेटास्टैटिक न्यूरोब्लास्टोमा67,68,69,70 की अस्थि मज्जा बायोप्सी से उत्पन्न होती है। यह सेल लाइन एनडी अनुसंधान में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला इन विट्रो मॉडल है, विशेष रूप से एडी, एचडी और पीडी जैसी बीमारियों के साथ, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन 10,43,71,72,73 में भारी फंसा हुआ है। संस्कृति मीडिया में हेरफेर के माध्यम से न्यूरॉन जैसे फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं में एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता ने प्राथमिक न्यूरोनल कोशिकाओं10,74 पर भरोसा किए बिना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त मॉडल साबित किया है। इस प्रोटोकॉल में, एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए सेल कल्चर माध्यम में रेटिनोइक एसिड (आरए) जोड़ा गया था। आरए एक विटामिन ए व्युत्पन्न है और सेल चक्र को विनियमित करने और प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है जो न्यूरोनल भेदभावको नियंत्रित करते हैं। चूहे हिप्पोकैम्पस से अलग न्यूरॉन्स के संवर्धन और लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है। हिप्पोकैम्पस को माइटोकॉन्ड्रियल अपघटन से प्रभावित दिखाया गया है और कॉर्टेक्स के साथ, उम्र बढ़ने और एनडी 76,77,78,79,80 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
यह प्रोटोकॉल लाइव सेल एसटीईडी इमेजिंग के लिए नए आईएमएम-टारगेटिंग पीकेएमओ डाई के साथ मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन एसएच-एसवाई 5 वाई और प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के उपयोग को प्रस्तुत करता है। पीकेएमओ की नवीनता के कारण, वर्तमान में लाइव एसटीईडी इमेजिंग के लिए इस डाई का उपयोग करके बहुत कम प्रकाशित किया गया है। एसटीईडी इमेजिंग के लिए इन सेल प्रकारों का उपयोग करना चुनौतियां पैदा करता है, विशेष रूप से क्योंकि न्यूरोनल कोशिकाओं में संकीर्ण माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा पीकेएमओ डाई का उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है। विभिन्न कोशिकाएं और सेल लाइनें डाई के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देती हैं, इस प्रकार, डाई एकाग्रता में समायोजन और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना मजबूत संकेत के लिए परिणामों को अनुकूलित करने के लिए इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता हो सकती है। एक सुझाया गया समाधान एकाग्रता को कम करना और धुंधला समय63 को बढ़ाना है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता में वृद्धि के बिना खराब धुंधलापन हो सकता है।
पीकेएमओ के समान, वाणिज्यिक डाई लाइव ऑरेंज माइटो (सामग्री की तालिका) भी कुछ सेल विषाक्तता प्रदर्शित करता है। इस डाई का उपयोग विभिन्न प्रकार की सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए किया गया था, लेकिन आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में उनके अविभाजित समकक्षों (हमारे अप्रकाशित अवलोकनों) के समान मापदंडों के साथ सफलतापूर्वक तुलनीय धुंधलापन प्रदर्शित करने में असमर्थ था। हालांकि, इस जांच और चुने हुए सेल प्रकारों के लिए उत्तरदायी धुंधला प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है। इस डाई के साथ, 1-1.05 से 7-7.05 एनएस के डिटेक्टर गेटिंग समय का उपयोग किया गया था, जिसमें तालिका 1 में अन्य सभी पैरामीटर समान थे। आम तौर पर, 45 मिनट के लिए 200-250 एनएम लाइव ऑरेंज माइटो के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने से पीकेएमओ परिणामों के समान परिणाम मिले। कम समय के लिए उच्च सांद्रता धुंधला होना या समान समय या थोड़े लंबे समय तक कम एकाग्रता धुंधला होना अलग-अलग परिणाम दे सकता है और अन्य सेल प्रकारों या विकास स्थितियों के अनुकूल हो सकता है।
इमेजिंग के समय अक्षतंतु और डेंड्राइट अनुमानों की प्रकृति के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के कारण इमेजिंग प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स अमर कोशिकाओं से भिन्न होते हैं। प्रोटोकॉल के इस हिस्से में एक कठिनाई यह है कि सीडिंग घनत्व यह निर्धारित करता है कि क्या प्राथमिक संस्कृतियां स्वस्थ रूप से पालन करने और बढ़ने में सक्षम होंगी, और उच्च घनत्व पर, अनुमान डीआईवी 10 से अधिक हो जाते हैं। इसलिए, इन प्राथमिक न्यूरॉन्स से चित्रित माइटोकॉन्ड्रिया संभवतः कोशिका शरीर से आएंगे और अनुमानों से नहीं; हालांकि, कम शुरुआती सेल घनत्व से सफल विकास बाद के विकास समय में बेहतर इमेजिंग परिणाम देता है। एसटीईडी के लिए सबसे अच्छा कंट्रास्ट होने के लिए कम पृष्ठभूमि और आउट-ऑफ-फोकस लाइट सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। सेल आबादी के बारे में चिंताओं को दूर करने के लिए, बी 27-पूरक न्यूरॉन विकास मीडिया में प्राथमिक हिप्पोकैम्पल कोशिकाओं का संवर्धन ग्लियल कोशिकाओं के विकास को रोकता है, और स्रोत की रिपोर्ट है कि <5% कोशिकाएं एस्ट्रोसाइट्स हैं और विकास मीडिया में एनबीएक्टिव 1 पूरक की अनुपस्थिति संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइट्स की संख्या <2% 87 तक कम हो जाती है। सुसंस्कृत एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स दोनों के लिए, विकास के लिए उपयोग की जाने वाली पीडीएल कोटिंग छवियों में पृष्ठभूमि धुंध में योगदान देती है। (तालिका 1) में रिपोर्ट की गई सेटिंग्स के साथ पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर पूरा किया जाता है और डीकन्वोल्यूशन देखी गई अधिकांश पृष्ठभूमि को हटा देता है।
यहां कवर की गई इमेजिंग के अलावा, इमेजिंग से पहले या दौरान कोशिकाओं में उपचार या तनाव जोड़ना भी संभव है। उदाहरण के लिए, टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोजन पेरोक्साइड (टीबीएचपी) जोड़ना ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है, और इसके बाद समय के साथ माइटोकॉन्ड्रिया में परिवर्तन की निगरानी करना संभव है। फ्लोरोसेंट टैग के साथ एमिलॉयड-β (ए) के अलावा माइटोकॉन्ड्रिया के साथ-साथ समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल संरचना के संबंध में इस पेप्टाइड के वितरण की निगरानी की अनुमति देता है। माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य को एडी में भारी फंसाया गया है और व्यापक रूप से ए विषाक्तता 43,71,72 में भूमिका निभाने के लिए समर्थित है। विशेष रूप से, SH-SY5Y कोशिकाओं की विभेदन स्थिति A3 प्रोटीन अग्रदूत (A3PP) स्थानीयकरण85 को प्रभावित करती है, और A3PP का उपयोग करने वाले प्रयोगों का सावधानीपूर्वक निर्माण किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल को कैसे अनुकूलित किया जा सकता है, इसके एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया है कि फ्लोरोसेंट संस्करण ए (1-42) -हाइलाइट 647 को इमेजिंग से 15 मिनट पहले पीकेएमओ-दाग वाली कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है (पूरक चित्रा 1)। इमेजिंग पैरामीटर समान हैं (पूरक तालिका 2), मुख्य अंतर यह है कि संकीर्ण माइटोकॉन्ड्रिया की इमेजिंग करते समय एक छोटे पिनहोल की आवश्यकता होती है। एसटीईडी के साथ इमेजिंग ए-हाइलाइट 647 को कम समग्र उत्तेजना (6% -8%) और एसटीईडी की कमी (10% -12%) लेजर शक्ति और कम संचय (छह) की आवश्यकता होती है। डिटेक्टर गेटिंग को भी 0.1 से 10 एनएस तक बढ़ाया जाता है। यद्यपि ए का एसटीईडी रिज़ॉल्यूशन आवश्यक नहीं है, कच्चे एसटीईडी का समग्र सिग्नल-टू-शोर अनुपात और ए कण आकार कॉन्फोकल छवियों की तुलना में बेहतर था, और बाद में डीकॉन्वोल्यूशन भी किया जा सकता है। एसटीईडी छवियों को एकत्र करना और एके कच्चे एसटीईडी जेड-स्टैक अनुमानों को अलग करना विशेष रूप से उपयोगी प्रतीत होता है जब पीकेएमओ दाग (पूरक चित्रा 1 बी, सी) के कच्चे एसटीईडी या डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवियों के साथ विलय किया जाता है। दोनों चैनलों को एक ही फ्रेम चरण में एकत्र किया गया था। समय-निर्भर स्थानीयकरण के माप, चित्र 2 में सूचीबद्ध और चित्रा 5 में दिखाए गए लोगों के समान, जहां लागू होते हैं, और क्रिस्टे आर्किटेक्चर अंतर तनाव उपचार या अन्य परिवर्धन के बाद प्राप्त किए जा सकते हैं।
माइटोकॉन्ड्रिया के लाइव सेल एसटीईडी में दोहरी-लेबलिंग के लिए अन्य संभावित तरीकों की रिपोर्ट यहां नहीं की गई है, लेकिन दूसरों द्वारा रिपोर्ट की गई है जिसमें एसएनएपी-टैग किए गए प्रोटीन93, हेलो-टैग ्ड प्रोटीन का उपयोग और सामान्य लक्ष्यों के साथ अन्य सेल-पारगम्य रंगों का उपयोग शामिल है, जैसे कि एमटीडीएनए63। विशेष रूप से, एसएनएपी और हेलो टैगिंग की लेबलिंग रणनीति इमेजिंग94 के दौरान परिणामी प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता और दीर्घायु को प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल विश्लेषण के कई उदाहरण प्रस्तुत करता है जिन्हें खंडित माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू किया जा सकता है, ऐसे कई अन्य विश्लेषण हैं जो सॉफ्टवेयर पैकेज इन छवियों पर कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की आपूर्ति कनेक्टिकट विश्वविद्यालय (स्टॉर्स, सीटी, यूएसए) में बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग के डॉ जॉर्ज लाइकोट्राफिटिस और शिजू गु द्वारा की गई थी। सेंटर फॉर ओपन रिसर्च रिसोर्सेज एंड इक्विपमेंट में एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी सुविधा में स्थित एब्बेरियर एसटीईडी उपकरण को एनआईएच अनुदान S10OD023618 क्रिस्टोफर ओ’कॉनेल को सम्मानित करने के साथ अधिग्रहित किया गया था। इस शोध को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था R01AG065879 नाथन एन एल्डर को सम्मानित किया गया था।
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
0.4% Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red | Gibco | 15400054 | |
100 X antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens | Olympus | Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4 | |
All-trans-retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) | AnaSpec | AS-64161 | Other fluorescent conjugates available |
B27 supplement (50 X), serum free | Gibco | 17504044 | |
Cell Counter (Countess II FL) | Life Technologies | AMQAF1000 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804-R | |
Counter slides | Invitrogen | C10283 | |
Conical tubes (15 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Cuvettes (Quartz Cells) | Starna Cells, Inc. | 9-Q-10 | Used with Spectrometer as described in Section 1.3 |
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) | Gibco | 11995073 | Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1 |
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) | Gibco | 11965092 | Used for primary cell materials as described in Section 2 |
DMEM (phenol red-free) | Gibco | 31053028 | Used for imaging as described in Section 3 |
DMSO | Sigma | D8418 | |
DNAase I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2 |
DPBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 14190144 | |
E18 Rat Hippocampus | Transnetyx Tissue | SDEHP | |
Ethanol (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP28184 | |
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated | Gibco | 26140079 | For cultured cells, in Section 1 |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10082147 | For primary cell culture, Section 2 |
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 5660010 | |
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in | — | — | Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text |
GlutaMAX supplement (100 X) | Gibco | 35050061 | Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2 |
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers | Hausser Scientific | 267110 | |
HBSS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 14170120 | Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2 |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) | Scientific Volume Imaging (SVI) | — | The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5 |
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus | Olympus | — | This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4 |
Lightbox software (V. 16.3.16118) | Abberior | — | Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4 |
Live Orange Mito dye | Abberior | LVORANGE-0146-30NMOL | Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion |
Neurobasal media | Gibco | 21103049 | Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2 |
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass | Nunc | 155379 | Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5 |
Pasteur Pipets (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22183632 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
PKmito Orange dye | Spirochrome | SC053 | |
Poly-D-lysine | Gibco | A3890401 | |
SH-SY5Y Cell line | ATCC | CRL2266 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | Used for primary cell materials described in Section 2 |
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) | Thermo Fisher Scientific | 840309000 | |
STED Expert Line microscope | Abberior | — | STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol |
T25 flask (TC-treated, filter cap) | Thermo Fisher Scientific | 156367 | Other culture vessels and sizes available |