Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

Summary

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Abstract

Os vetores virais adenoassociados recombinantes (rAAV) podem alcançar expressão transgênica potente e durável sem integração em uma ampla gama de tipos de tecidos, tornando-os uma escolha popular para entrega gênica em modelos animais e em ambientes clínicos. Além das aplicações terapêuticas, os rAAVs são uma ferramenta laboratorial útil para fornecer transgenes adaptados às necessidades experimentais e objetivos científicos do pesquisador em células cultivadas. Alguns exemplos incluem genes repórteres exógenos, de superexpressão, interferência de RNA e ferramentas baseadas em CRISPR, incluindo aquelas para telas genômicas amplas. As transduções de rAAV são menos nocivas às células do que a eletroporação ou a transfecção química e não requerem nenhum equipamento especial ou reagentes caros para serem produzidas. Lisados brutos ou meios condicionados contendo rAAVs podem ser adicionados diretamente às células cultivadas sem purificação adicional para transduzir muitos tipos de células – uma característica subestimada dos rAAVs. Aqui, fornecemos protocolos para clonagem básica de transgênico e demonstramos como produzir e aplicar preparações brutas de rAAV em células cultivadas. Como prova de princípio, demonstramos a transdução de três tipos celulares que ainda não foram relatados em aplicações de rAAV: células placentárias, mioblastos e organoides do intestino delgado. Discutimos os usos apropriados para preparações brutas de rAAV, as limitações dos rAAVs para entrega de genes e considerações para a escolha do capsídeo. Este protocolo descreve um método simples, de baixo custo e eficaz para os pesquisadores alcançarem a entrega produtiva de DNA em cultura de células usando rAAV sem a necessidade de etapas trabalhosas de titulação e purificação.

Introduction

A elucidação das bases moleculares das funções celulares frequentemente requer a expressão de DNA transgênico em cultura celular. Para serem expressos, os transgenes devem penetrar através da membrana seletiva de uma célula e atingir o núcleo ^1,2. Portanto, a capacidade de efetivamente ultrapassar as barreiras físicas da célula e manipular seus processos centrais é uma necessidade para a aplicação da transgênese para descobrir novos fenômenos biológicos. Uma abordagem capitaliza a capacidade intrínseca dos vírus de entregar e expressar DNA estranho ^3,4.

O vírus adenoassociado (AAV) é um dos menores vírus de mamíferos: seu genoma de DNA de fita simples de 4,7 quilobases (kb) contém dois genes, rep (para replicase) e cap (para capsídeo), empacotados dentro de um capsídeo icosaédrico de 60 meros medindo 25 nm. Os genes rep/cap possuem múltiplos promotores, quadros de leitura e produtos de emenda que codificam pelo menos nove proteínas únicas necessárias para replicação, produção e empacotamento viral ^5,6. Além disso, ambas as extremidades do genoma contêm estruturas secundárias denominadas repetições terminais invertidas (ITRs), necessárias para a replicação do DNA, empacotamento do genoma e processamento a jusante durante a transdução 7,8,9,10. Os ITRs são os únicos elementos de DNA necessários para o empacotamento do genoma no capsídeo e, portanto, os AAV podem ser clonados para fins de entrega de transgenes, substituindo os genes rep/cap virais pela escolha do pesquisador de elementos regulatórios e/ou genes de interesse⁶. O AAV recombinante resultante (rAAV), com genoma vetorial modificado (VG), é amplamente utilizado na clínica para terapia gênica humana e tem acumulado sucessos¹¹. Um uso subestimado do vetor está no laboratório; Os rAAVs podem eficientemente alcançar a expressão de transgenes em células cultivadas para atender às necessidades experimentais de um pesquisador¹².

O método mais comum para a produção de rAAV é por transfecção de plasmídios triplos em células HEK293 ou 293T (Figura 1). O primeiro plasmídeo, comumente chamado de plasmídeo cis, contém o transgene desejado flanqueado por ITRs (pAAV). Dependendo da aplicação, plasmídeos cis com elementos comuns, como promotores fortes ou ferramentas baseadas em CRISPR, estão disponíveis para compra. O segundo é o plasmídeo pRep/Cap que contém os genes wild-type AAV rep e cap fornecidos in-trans – ou seja, em um plasmídeo separado, não contendo ITR que expressa elementos regulatórios e estruturais que então interagem com o plasmídeo cis – e é assim chamado de plasmídeo trans. Além de envolver fisicamente o VG, o capsídeo influencia o tropismo celular^12,13. Ao fornecer o gene cap específico do sorotipo in-trans, os pesquisadores são facilmente capazes de maximizar a eficiência da transdução escolhendo um sorotipo de capsídeo otimizado para sua célula-alvo dada. Por fim, como Dependoparvovírus, o AAV necessita de um vírus auxiliar para ativar a expressão rep/cap de seus promotores virais, conseguida por genes adenovirais auxiliares, fornecidos em um terceiro plasmídeo como o pAdΔF6^14,15. Após 72 h de transfecção triplo-plasmidial, o vetor pode ser liberado das células produtoras para o meio de cultura por ciclos repetidos de congelamento/descongelamento. Todo o conteúdo da placa é então coletado, e grandes detritos celulares são removidos por centrifugação; o sobrenadante do meio resultante é uma preparação bruta de rAAV pronta para transduções a jusante.

Figura 1: Visão geral da produção bruta de vetores rAAV. A produção e transdução de rAAV bruto pode ser realizada dentro de 5 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O rAAV pode ser mais favorável para a liberação de transgênicos em comparação com outros métodos de transfecção, que são comumente associados à toxicidade celular, baixa eficiência e reagentes e equipamentos caros, como para eletroporação ou transfecção química/lipídica^16,17. O rAAV contorna esses obstáculos e frequentemente fornece expressão potente de transgênicos com toxicidade mínima e tempo mínimo de prática. É importante ressaltar que a produção do rAAV e sua aplicação em cultura celular é simples e raramente requer a purificação do vetor do meio de cultura (Figura 1). Além disso, o rAAV não integra seu VG ao genoma do hospedeiro, ao contrário da liberação de transgenes lentivirais, diminuindo, assim, o risco de mutagênese insercional¹⁸. Apesar dos potenciais benefícios do uso do rAAV para liberação de transgenes, limitações devem ser consideradas. É importante ressaltar que o tamanho do transgene, incluindo os ITRs, não deve exceder 4,9 kb devido a restrições físicas do capsídeo, limitando assim a capacidade de um pesquisador de efetivamente entregar grandes elementos regulatórios e transgenes. Além disso, como o rAAV é um vírus não integrador, a transdução resulta em expressão transitória de transgênicos em células em divisão e pode não ser prática para expressão estável. No entanto, métodos que usam Cas9 duplo entregue por rAAV e modelos de reparo direcionado por homologia (HDR) podem ser usados para inserir sequências de forma estável em loci genômicos específicos, se um pesquisador desejar¹⁹.

Protocol

1. Aquisição do plasmídeo

NOTA: Este protocolo irá clonar um gene de interesse (GOI) em um plasmídeo contendo ITR com um promotor de citomegalovírus (CMV) e uma sequência de poliadenilação SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). No entanto, este plasmídeo pode ser usado sem clonagem adicional para produzir rAAVs, empacotando um conveniente repórter duplo EGFP e Luciferase. Plasmídeos com diferentes elementos regulatórios ou para diferentes aplicações, como para experimentos baseados em CRISPR, estão disponíveis on-line e seguirão etapas de clonagem semelhantes às abaixo (consulte a discussão para etapas adicionais de clonagem). Além disso, plasmídeos rep/cap, ou trans, para diferentes sorotipos podem ser usados – este protocolo usará rep/cap para o sorotipo 2 do AAV.

1. Compre facadas bacterianas contendo um plasmídeo cis contendo ITR, um plasmídeo auxiliar de adenovírus, um plasmídeo rep/cap e um plasmídeo contendo um GOI. Estriar as bactérias em placas individuais de ágar contendo antibióticos específicos para a resistência de cada plasmídeo. Incubar as bactérias a 30 °C durante a noite para crescer.
   NOTA: Se um plasmídeo com uma GOI não estiver prontamente disponível para compra, um fragmento de DNA sintético (consulte a Tabela de materiais) pode ser comprado on-line. Além disso, um fragmento de DNA sintético pode ser usado para pular todo o processo de PCR, se desejado.
2. Escolher uma única colónia de cada placa e crescer em 3 ml de tampão Luria Bertani (LB) suplementado com o antibiótico correspondente a 30 °C durante a noite, agitando a 180 rpm. Transferir 1 ml da bactéria para um balão Erlenmeyer estéril de 250 ml, contendo 50 ml de tampão LB suplementado com o antibiótico correspondente. Agite a 30 °C, 180 rpm durante a noite.
3. Transfira as bactérias para um tubo cônico de 50 mL e centrífuga por 20 min a 3.000 x g, temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Isole o plasmídeo usando um kit de midiprep baixo ou livre de endotoxinas, de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: ITRs são estruturas instáveis. Para evitar deleções ou mutações do ITR, as células bacterianas devem ser cultivadas a 30 °C para retardar a divisão celular e mitigar erros na replicação. Para aumentar o rendimento e a pureza do plasmídeo, um kit de midiprep ou maxiprep é ideal. Recomenda-se o uso de um kit baixo ou livre de endotoxinas para reduzir a contaminação das células por endotoxina a jusante. Não é necessário realizar o isolamento de plasmídeos dentro de uma capela de fluxo laminar, pois a contaminação da preparação de plasmídeos não é provável se realizada em uma bancada padrão.

2. Clonagem de genes de interesse em plasmídeo contendo AAV ITR

1. Abra o mapa do plasmídeo contendo o GOI em um software de visualização de DNA.
   NOTA: O completo, incluindo os ITRs, não deve exceder 4,9 kb devido a limitações físicas de embalagem do capsídeo. Além disso, a amplificação por PCR não pode ser obtida através de ITRs devido a estruturas secundárias. Como tal, a montagem de Gibson não é recomendada para clonagem de transgenes rAAV.
   1. Clique na guia Sequência para revelar a sequência completa do plasmídeo. Role até a região mais 5' da sequência GOI e clique no Primeiro Nucleotídeo enquanto arrasta para dentro em direção ao corpo do gene para criar um primer para frente. Libere uma vez que uma temperatura de fusão (Tm) de ~55 °C tenha sido atingida.
   2. Clique em Encaminhar Cartilha. Inclua manualmente a sequência para um local de restrição EcoRI (5' GAATTC 3') na extremidade máxima de 5' da sequência de primers. Além disso, adicione seis bases aleatórias extras no final de 5' deste local de restrição para permitir que a enzima interaja eficientemente com o DNA. Clique em Adicionar Cartilha. Consulte a Figura 2 para obter um exemplo representativo.
   3. Verifique o primer para garantir que ele não pode formar grampos de cabelo ou dímeros de primer (exceto para o local de restrição que é palindrômico). Se os grampos de cabelo se formarem, altere a sequência aleatória das seis bases extras. Além disso, certifique-se de que o primer não se ligue a nenhum outro lugar no plasmídeo.
   4. Repita as etapas para criar um primer reverso na região 3' mais interna do GOI para dentro do corpo do gene. Clique em Reverse Primer e inclua um site de restrição NotI (5' GCGGCCGC 3').
      NOTA: O GOI não pode conter locais de restrição EcoRI ou NotI – em caso afirmativo, enzimas de restrição diferentes precisarão ser usadas.
2. Amplificar o GOI em uma reação de PCR de 50 μL. Use os componentes individuais necessários da Tabela 1.
   1. Coloque a reação em um termociclador e siga os parâmetros do ciclo da Tabela 2 para programação. Se os primers tiverem T m diferente, use o T_m inferior para o programa.
   2. Verificar a amplificação do fragmento correto da PCR adicionando 1 μL de corante de carga de gel (6x) a 5 μL de reação de PCR. Execute uma escada de DNA e a mistura de PCR em um gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídio e visualize com luz UV.
      CUIDADO: O brometo de etídio é um agente mutagênico conhecido.
   3. Se aparecer uma única faixa específica no gel, purifice o produto PCR restante no tubo da tira de PCR usando um kit de limpeza de PCR baseado em coluna, de acordo com as instruções do fabricante. Se aparecerem várias bandas (devido à amplificação não específica), excise a banda desejada e purifique o DNA usando um kit de extração em gel, de acordo com as instruções do fabricante.
3. Digerir o produto purificado da PCR e o plasmídeo da espinha dorsal pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 em uma reação de 50 μL com os componentes individuais necessários da Tabela 3 por 1 h a 37 °C. Uma maior quantidade de DNA plasmidial pAAV é necessária devido à recuperação ineficiente esperada após a extração em gel.
   NOTA: As enzimas de restrição utilizadas são versões de alta fidelidade (HF). Regular NotI não pode ser usado com buffer CutSmart. Se estiverem a ser utilizadas enzimas diferentes, pode ser necessária uma temperatura de incubação e tampão diferentes.
   1. Purifice o produto PCR digerido com um kit de limpeza PCR baseado em coluna, de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Preparar o plasmídeo de backbone pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 digerido para eletroforese em gel, adicionando 10 μL de corante de carga de gel (6x) a 50 μL de reação de digestão. Carregar uma escada de DNA, reação de digestão e 250 ng de plasmídeo não digerido (controle negativo) em um gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídio com poços de dentes largos. Visualize com luz UV, extire o fragmento desejado (~4,5 kb) e purifique o DNA usando um kit de extração em gel de acordo com as instruções do fabricante.
4. Ligate o produto da PCR digerido e o plasmídeo da espinha dorsal do pAAV digerido em uma reação de ligadura de 20 μL com os componentes individuais necessários da Tabela 4. Para calcular a quantidade de produtos de PCR necessários, use a Fórmula 1. Normalmente, use uma razão molar de 3:1 do produto da PCR (insert) para a espinha dorsal (pAAV), com uma massa de 50 ng backbone.
   Fórmula 1
5. Realizar um controle negativo substituindo o produto PCR por água. Incubar as reações de ligadura a 16 °C durante a noite ou à temperatura ambiente durante 2 horas.
6. Descongelar um frasco de células bacterianas competentes e deficientes em recombinação (como células Stbl3) no gelo e colocar 50 μL em um tubo de 1,5 mL. Adicionar 3 μL da reação de ligadura diretamente sobre as células e incubar no gelo por 30 min.
   NOTA: ITRs são estruturas instáveis e, portanto, requerem cepas bacterianas deficientes em recombinação para limitar os eventos de deleção e recombinação de ITR. As células DH5α podem ser usadas intermitentemente para propagação (uma ou duas vezes), mas não são recomendadas para uso a longo prazo. A integridade do ITR deve ser verificada regularmente após a purificação do midiprep.
   1. Choque térmico das bactérias em banho-maria a 42 °C por 30 s e transferir imediatamente para o gelo por 2 min. Adicionar 200 μL de tampão LB e agitar durante 1 h a 30 °C, 180 rpm.
   2. Espalhe 125 μL da mistura em uma placa de ágar com o antibiótico correspondente e incube durante a noite (~18 h) a 30 °C. Escolha vários clones e coloque cada um em um tubo de cultura plástico estéril com 3 mL de LB contendo o antibiótico correspondente. Incubar agitando durante a noite a 30 °C, 180 rpm.
      NOTA: Para evitar deleções ou mutações do ITR, as células bacterianas devem ser cultivadas a 30 °C para retardar a divisão celular e mitigar erros na replicação. Além disso, colônias menores devem ser colhidas, pois aquelas sem ITRs podem ter uma vantagem de crescimento sobre outras.
   3. Pipetar 1,8 mL de cada cultura em um tubo de 2 mL e centrifugar a 6.000 x g por 3 min, temperatura ambiente. Isole o DNA usando um kit de miniprep. Conservar os restantes 1,2 ml de cultura a 4 °C. Verificar clones corretos por sequenciamento de DNA ou digestão de enzimas de restrição diagnóstica.
      NOTA: O sequenciamento de Sanger da inserção é recomendado, mas a processividade através de ITRs não é alcançável pelos métodos padrão. Os ITRs devem ser verificados por digesto de restrição, conforme descrito abaixo.
   4. Adicionar 50 ml de tampão LB contendo o antibiótico correspondente a um balão Erlenmeyer estéril de 250 ml. Adicionar 500 μL da cultura restante ao balão e agitar a 30 °C, 180 rpm até atingir um OD₆₀₀ de 0,2-0,5 (~18 h). Transferir as bactérias para um tubo cônico de 50 mL e centrifugar por 20 min a 3.000 x g, 4 °C. Isolar o DNA usando um kit de midiprep baixo ou livre de endotoxinas.
   5. Verifique a integridade do ITR com 20 μL de digestão de enzima de restrição diagnóstica usando XmaI (ou SmaI). Preparar uma reação contendo 500 ng de plasmídeo, 0,5 μL de enzima e 1x de tampão; Incubar durante 1 h a 37 °C. Execute a reação em um gel de agarose a 0,8%. Se os ITRs estiverem intactos, a digestão dará uma banda a ~2,9 kb e outra banda do tamanho do. Se essa faixa distinta não for observada, o ITR pode não estar intacto, e a clonagem precisará ser refeita.
      NOTA: Plasmídeos contendo sítios de restrição XmaI (ou SmaI) (além daqueles nos ITRs) terão bandas adicionais aparecendo no gel.

Figura 2: Exemplo representativo para o projeto do primer. Projeto de primer para frente e para trás para um transgene mScarlet (exemplo representativo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quantidade	Componente
X μL	Modelo de DNA (25 ng)
1 μL	Primer F (10 μM)
1 μL	Primer R (10 μM)
1 μL	dNTP (10 mM)
10 μL	Buffer Phusion (5x)
1 μL	Phusion Polimerase
X μL	Água
50 μL	Final Volume

Tabela 1: Reagentes de amplificação por PCR. Os componentes necessários para uma reação de PCR bem-sucedida.

Passo	Temperatura	Hora
Desnaturação Inicial	98 °C	1 min
30 Ciclos	98 °C	10 s
	Tm de Primer	Anos 30
	72 °C	30 s por kb
Extensão Final	72 °C	10 minutos
Segurar	4 °C	indefinidamente

Tabela 2: Programação da amplificação da PCR. Os parâmetros de ciclagem necessários para uma reação de PCR bem-sucedida.

Quantidade	Componente
X μL	Produto de PCR (1μg) ou plasmídeo pAAV (3μg)
5 μL	Buffer (10x)
1 μL	EcoRI-HF
1 μL	NotI-HF
X μL	Água
50 μL	Final Volume

Tabela 3: Reagentes de digestão. Os componentes necessários para uma reação de digestão bem-sucedida.

Quantidade	Componente
X μL	Inserir (X ng)
X μL	Espinha dorsal (50 ng)
2 μL	T4 DNA Ligase Tampão (10x)
1 μL	T4 DNA Ligase
X μL	Água
20 μL	Final Volume

Tabela 4: Reagentes de ligadura. Os componentes necessários para uma reação de ligadura bem-sucedida.

3. Produção de vetores com transfecção de plasmídios triplos

NOTA: Os valores a seguir são otimizados para um único poço de uma placa de 6 poços que produz um volume final de preparação bruta de 2 mL. Todos os valores podem ser ampliados em 10x para uma placa de 15 cm que produz um volume final de 20 mL ou reduzidos em 4x para uma placa de 24 poços com um volume final de 500 μL.

1. Completar um stock de 1 μg/μL de cloridrato de polietilenimina (PEI) MAX dissolvendo 100 mg de PEI MAX em 100 ml de água destilada. Ajustar o pH para 7,1 com NaOH. Filtrar esterilizar a mistura com um filtro de 0,22 μm e congelar alíquotas de 1 ml a -20 °C para armazenamento a longo prazo. Depois de descongelado, conservar o reagente durante 1 mês a 4 °C.
2. Sementes 3 x 10 5 HEK293 ou células HEK293T em uma placa de 6 poços com meio de águia modificado de Dulbecco pré-aquecido (DMEM,^4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruvato de sódio) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Crescer até ~75%-90% de confluência em uma incubadora definida a 37 °C e 5% CO₂ (Figura 3).
   NOTA: Células cultivadas com penicilina/estreptomicina (P/S) têm sido observadas para diminuir o rendimento de produção do vetor. O uso de técnica estéril adequada evita a necessidade do uso de P/S e, portanto, recomenda-se não cultivar células HEK293 com antibiótico²⁰. Se P/S for necessário em transduções a jusante, recomenda-se adicionar P/S à preparação bruta após a colheita.
3. Em um tubo de 2 mL, prepare uma mistura contendo 1,3 μg de pAAV2/2 (Rep/Cap, sorotipo 2), 1,3 μg de pAAV.GOI, 2,6 μg de pAdΔF6 e DMEM sem soro (SF) (4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruvato de sódio) em um volume total de 100 μL (ver Tabela Suplementar 1 para cálculos convenientes).
4. Prepare um controle negativo em um tubo separado substituindo pRep/Cap por qualquer plasmídeo não relacionado. O controle negativo é responsável pelo plasmídeo pAAV.GOI não embalado presente na preparação bruta que poderia transfectar células durante a transdução, embora raro.
   NOTA: O plasmídeo maxiprep ou midiprep baixo ou livre de endotoxina é ideal para tripla-transfecção e geralmente produz um vetor de título mais alto em comparação com o DNA miniprep, embora o DNA miniprep possa ser usado para testes preliminares rápidos e sujos.
5. Adicionar 5,2 μL de PEI MAX à mistura de plasmídeos; trata-se de uma mistura plasmídeo:PEI na proporção de 1:1. Misture bem pulsando 10-15 vezes em um misturador de vórtice definido para 7. Se várias preparações vetoriais forem produzidas, adicione PEI a cada mistura de plasmídios em intervalos de tempo escalonados de 1 min (ou seja, preparação 1 em t = 0 min, preparação 2 em t = 1 min, etc.) para permitir tempo suficiente para aspirar poços e diluir a reação nas etapas seguintes.
   NOTA: Observou-se que uma proporção de 1:1 de plasmídeo:PEI é ótima. No entanto, usuários individuais podem otimizar essa proporção para máxima eficiência. Consulte a discussão para saber como executar a otimização do PEI (consulte também a Tabela Suplementar 2).
6. Incubar cada tubo por exatamente 15 min e, em seguida, diluir a reação com 1,9 mL de SF DMEM (4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruvato de sódio) para um volume final de 2 mL. Pipetar suavemente 2x para misturar. A mistura excessiva interromperá os complexos Plasmídeo/PEI e resultará em menor eficiência de transfecção.
7. Aspirar o meio do poço e adicionar a mistura plasmídeo:PEI suavemente nos lados do poço para evitar o descolamento celular. Incubar as células durante 72 h a 37 °C e 5% de CO₂. A lise e desprendimento celular durante a incubação é um processo normal de produção de rAAV (Figura 4).

Figura 3: Células HEK293 prontas para transfecção. A confluência ideal (75%-90%) de células HEK293 necessária para a transfecção de plasmídios triplos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Células HEK293 após transfecção. O aparecimento de células HEK293 antes e após 1, 2 ou 3 dias após a transfecção com pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2 , pAdΔF6 e proporção 1:1 de plasmídeo:PEI . Barras de escala: 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Colheita de preparações vetoriais brutas

1. Congelar toda a placa de células transfectadas por 30 min a -80 °C, seguido de descongelar por 30 min a 37 °C. Repita para um total de três ciclos de congelamento/descongelamento. Não retire a tampa – a placa deve permanecer estéril por dentro. As placas podem permanecer a -80 °C até estarem prontas para prosseguir para as próximas etapas.
   NOTA: Uma incubadora não umidificada funciona melhor para o descongelamento, o que minimiza a condensação na parte externa das placas que pode levar à contaminação acidental.
2. Execute as duas etapas a seguir em uma capela de fluxo laminar usando técnicas assépticas. Misture cada poço por pipetagem para garantir a máxima ruptura das células. Transfira o lisado para um tubo de 2 mL e centrifuga por 15 min a 15.000 x g, temperatura ambiente para remover detritos celulares.
3. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL. Esta preparação bruta pode ser usada imediatamente sem titulação ou purificação. O vetor pode ser armazenado a 4 °C por vários meses ou -20 °C por anos.
   NOTA: Se necessário, os títulos podem ser calculados por PCR quantitativo (qPCR) quantificando o número de genomas vetoriais (VG) dentro de partículas resistentes à DNase. Como tal, os títulos são administrados em unidades de VG/mL. O vetor armazenado por vários meses a 4 °C deve ser retitulado antes do uso, pois o vetor pode agregar e/ou ligar as paredes do tubo, reduzindo o título da preparação.

5. Transdução

1. Plaquear o tipo de célula desejado (por exemplo, Huh7) em uma placa de 96 poços em uma confluência alvo de 50%-75%, dependendo da duração da transdução. Uma maior confluência pode resultar em redução da eficiência da transdução do AAV.
2. Adicionar vetor (por exemplo, CMV.mScarlet) às células sem conhecer o título da preparação bruta para aplicações onde a dose não é relevante, como testar um painel de capsídeos para transdução em um novo tipo de célula. Realizar uma série de diluição 1:3 da preparação bruta em meio sem soro (SF) para obter a quantidade ideal de vetor necessária para a aplicação. Aspirar o meio da placa de 96 poços e adicionar 50-100 μL de preparação bruta diluída aos poços. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂.
   NOTA: O soro pode conter anticorpos que podem neutralizar o vetor AAV e reduzir a eficiência da transdução. No entanto, o soro pode ser usado durante a transdução para tipos celulares sensíveis.
3. Remover o vetor após 48 h pós-transdução (hpt) e lavar as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS). Os vetores também podem ser removidos e substituídos por meios contendo soro assim que 2 hpt para tipos de células sensíveis. Para muitas aplicações, realize incubação durante a noite para transduzir células e substituir poços por meios contendo soro fresco pela manhã. Tipos de células robustas, como Huh7 e U2-OS, não exigem uma mudança de mídia.
4. Finalizar a transdução fixando as células em paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 min. Vários métodos de terminação também podem ser usados com base na aplicação (por exemplo, lise). Para a maioria dos tipos celulares, o pico de expressão ocorre por 48 hpt e, portanto, é um desfecho experimental comum.

6. Variações no método de transdução por tipo de célula

Observação : diferentes tipos de células exigem condições de cultura diferentes. Portanto, a adição de vetor para transdução deve ser otimizada com base nas necessidades do tipo celular. Abaixo estão protocolos de transdução muito específicos para os tipos celulares incluídos nos resultados representativos, ilustrando algumas variações de protocolos de transdução que um pesquisador pode querer tentar para suas próprias necessidades.

1. Organoides do intestino delgado de camundongos
   1. Derivar organoides do intestino delgado de camundongos (mSIOs) de uma preparação de cripta do intestino delgado de camundongos C57BL/6J. Incorporar organoides em matriz de membrana basal a 90% e cultura em placas de 24 poços contendo meio de crescimento organoide (sem antibióticos) ou meio de pré-transdução (meio condicionado com 50% Wnt3a [produzido internamente usando células L Wnt-3A em meio de crescimento organoide], nicotinamida 10 mM, inibidor de ROCK 10 μM e CHIR99021 2,5 μM) por uma passagem (5-7 dias) antes da transdução a 37 °C e 5% CO₂.
   2. Antes da transdução, lave os organoides com D-PBS, interrompa as cúpulas da matriz da membrana basal por pipetagem e dissociar os organoides em pequenos aglomerados de células incubando-os em meio de dissociação por 10 min a 37 °C e pipetagem adicional.
   3. Pare o processo de dissociação celular adicionando 5% FBS em DMEM/F-12 com 15 mM HEPES, transfira clusters de células para tubos de centrífuga e colete clusters de células por centrifugação por 5 min a 1000 x g, temperatura ambiente.
   4. Ressuspender os aglomerados celulares em meio de transdução (meio de pré-transdução contendo 10 μg/mL de polibreno ou meio de crescimento organoide contendo 10 μg/mL de polibreno) e transferir para placas de 48 poços, seguido da adição de preparações brutas de AAV embalando CMV.mScarlet para transdução.
   5. Efectuar a transdução de organoides centrifugando a placa durante 1 h a 600 x g e 37 °C e, em seguida, incubar a 37 °C durante mais 6 horas. Coletar organoides transduzidos em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, centrifugar por 5 min a 1000 x g, temperatura ambiente e colocar gelo.
   6. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender organoides transduzidos em matriz de membrana basal a 90% em meio de pré-transdução ou meio de crescimento organoide e gotículas de sementes de 20 μL em um poço de vidro de cobertura com câmara pré-aquecida.
   7. Após incubação por 10 min na incubadora, incorporar a gotícula em 350 μL de meio de pré-transdução ou meio de crescimento organoide e incubar a 37 °C na incubadora. Determinar a eficiência da transdução 2-5 dias após a transdução por imagem dos organoides transduzidos em um microscópio confocal e estimar a porcentagem de células fluorescentes vermelhas por organoide.
2. Células BeWo
   1. Às 24 h antes da transdução, placa de células BeWo de coriocarcinoma placentário humano a 10.000 células por poço de placa de 96 poços. Diluir preparações brutas de AAV embalando CMV.mScarlet a 1:1 em meio F12-K BeWo sem soro até um volume total de 50 μL por poço. Aspirar o meio do poço e substituir por 50 μL de AAV diluído por poço.
   2. Incubar as células a 37 °C durante a noite (~18 h) e, em seguida, adicionar 100 μL de meio BeWo F12-K contendo 10% de FBS para aumentar o volume total para 150 μL. Incubar as células por mais 6 h para um total de 24 h pós-transdução (hpt).
   3. Para aquisição de imagens, core as células vivas com corante Hoechst por 30 minutos em meio F12-K e, em seguida, troque o meio por DMEM livre de fenol contendo 10% de FBS, 1x suplemento de glutamax e 1x suplemento de piruvato de sódio para geração de imagens. Realizar imagens de células vivas em um microscópio confocal usando conjuntos de filtros DAPI (para imagens Hoechst) e mCherry (para imagens mScarlet) com 37 °C e 5% de CO₂.
3. Células Hepa1-6 e Huh7
   1. Células hepáticas Hepa1-6 murinas em placas e células hepáticas Huh7 humanas em DMEM (4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruvato de sódio, 10% de SFB) a 5.000 células por poço de uma placa de 96 poços 24 h antes da transdução.
   2. Adicionar 50 μL de preparações brutas de AAV não diluídas embalando CMV.mScarlet directamente às células e incubar a 37 °C durante 48 h. Lave as células uma vez em PBS, fixe em PFA a 4% e core com corante Hoechst por 10 min. Conduza imagens em um microscópio confocal usando os conjuntos de filtros DAPI (para imagens Hoechst) e mCherry (para imagens mScarlet).
4. Células C2C12 e HSkMC
   1. Mioblastos murinos C2C12 em placa indiferenciada e mioblastos de células musculares esqueléticas primárias humanas indiferenciadas (HSkMC) a 5.000 células por poço de uma placa de 96 poços, 72 h antes da transdução.
   2. Diluir preparações brutas de AAV embalando CMV.mScarlet a 1:1 em DMEM (4,5 g/L de glicose, Penn/Strep, 20% FBS) para mioblastos C2C12 ou meios de crescimento muscular esquelético para mioblastos HSkMC. Diferenciar mioblastos HSkMC em miotubos, alterando o meio para o meio de diferenciação.
   3. Incubar mioblastos e miotubos em preparações diluídas de AAV durante 24 h a 37 °C. Corar células vivas com corante Hoechst por 10 min e imagem em microscópio confocal usando os conjuntos de filtros DAPI (para imagens Hoechst) e mCherry (para imagens mScarlet).

Results

Encontrando o capsídeo ideal para transdução de células cultivadas de interesse
Uma variedade de tipos celulares foi transduzida para determinar o tropismo de vários sorotipos de capsídeos (Figura 5). Os sorotipos naturais AAV2¹⁴, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 e as variantes de capsídeos projetados Anc80 25, DJ 26, LK03²⁷ e^{KP1 28} foram empacotados com um genoma vetorial expressando mScarlet sob um promotor de CMV, clonado usando os métodos fornecidos neste protocolo. Preparações vetoriais brutas sem titulação foram diluídas nos meios de cultura apropriados e as células foram transduzidas por 24+ h e imageadas (Figura 5B). A eficiência de transdução foi calculada pela proporção de células totais que eram mScarlet+, ou a proporção de células em um único plano z que eram mScarlet+ (para organoides do intestino delgado de camundongos; Figura 5C). As eficiências de transdução (células mScarlet+) não são fornecidas para miotubos diferenciados de C2C12 e HSkMC, mas sim para mioblastos indiferenciados de C2C12 e HSkMC (Figura 5A).

AAV2 e KP1 foram os sorotipos mais potentes entre as linhagens celulares testadas (Figura 5A). Observou-se também que tipos celulares similares originários de espécies diferentes são transduzidos em eficiências variadas. Por exemplo, Hepa1-6 (uma linhagem de células hepáticas derivada da murina) exibe uma diminuição acentuada na transdução em comparação com Huh7 (uma linhagem de células hepáticas derivada de humanos) quando se usa AAV2 (Figura 5B). Além disso, diferentes condições de meios desempenham um papel importante durante a transdução. Organoides do intestino delgado de camundongos (mSIOs) cultivados em meios de pré-transdução são transduzidos de forma menos eficaz em comparação com aqueles cultivados em meios de crescimento organoides (Figura 5C). Além disso, o AAV2 transduz eficientemente mioblastos HSkMC indiferenciados e miotubos HSkMC diferenciados (Figura 5B), embora a análise quantitativa dos miotubos seja difícil e, portanto, não seja fornecida.

As altas eficiências de transdução observadas para vários tipos celulares na Figura 5 mostram que preparações vetoriais brutas podem ser usadas efetivamente para transduzir uma variedade de tipos celulares sem etapas adicionais, como purificação e titulação. No entanto, deve-se considerar cuidadosamente ao escolher um capsídeo para maximizar a entrega de transgenes. Muitas outras linhagens celulares e capsídeos foram previamente testados e estão publicados, embora com preparações vetoriais purificadas¹².

Um efeito independente de partículas vetoriais das condições do meio pode afetar a eficiência da transdução. No entanto, é geralmente aceito que o tropismo (isto é, absorção e expressão de vetor específicos do tipo celular) é uma propriedade específica do capsídeo²⁹. Uma comparação entre preparações cruas e purificadas pareadas com dose ainda não foi observada para afetar o tropismo celular. Portanto, preparações vetoriais brutas podem ser usadas de maneira semelhante a vetores purificados em cultura celular.

Figura 5: Transdução vetorial bruta de vários tipos celulares . (A) Porcentagem de mScarlet+ após a adição de vários vetores AAV contendo um transgene mScarlet . (B) Células que expressam mScarlet liberadas do sorotipo 2 do AAV. Barras de escala: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 e HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abreviações: hpt = horas pós-transdução. (C) Organoides do intestino delgado de camundongos (mSIOs) foram tratados com rAAV em meios de pré-transdução ou meios de crescimento organoides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Planilha de transfecção de plasmídeos triplos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Planilha de otimização do PEI. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Clonagem
O protocolo de clonagem não se limita ao plasmídeo pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 usado acima e pode ser facilmente alterado com base nas necessidades experimentais do pesquisador. Muitos plasmídeos contendo ITR estão prontamente disponíveis on-line para compra. Por exemplo, plasmídeos contendo Cas9 e um sítio de clonagem de sgRNA estão disponíveis, mas requerem poucas etapas adicionais, como recozimento de oligonucleotídeos e tratamento com PNK³⁰. Além disso, plasmídeos contendo um sítio de clonagem múltipla (SCM) com apenas ITRs e sem elementos reguladores internos podem ser encontrados³¹. Se plasmídeos diferentes devem ser usados, as enzimas de restrição (ER) usadas para digestão são tipicamente os únicos elementos que podem precisar ser alterados neste protocolo. No entanto, uma limitação do rAAV é sua capacidade de carga limitada. Devido às limitações físicas do capsídeo, o genoma do vetor não deve exceder 4,9 kb, incluindo os ITRs.

Ao isolar plasmídios de bactérias, é fundamental usar um kit de midiprep ou maxiprep com baixo teor de endotoxinas ou livre para mitigar danos às células durante a transfecção ou transdução de plasmídios triplos. O plasmídeo dos kits de miniprep geralmente contém impurezas mais altas, concentrações reduzidas e menos DNA superenrolado, o que pode afetar a produção a jusante do rAAV e, portanto, não é recomendado.

É fundamental entender a estrutura e as propriedades dos ITRs durante a clonagem. Primeiro, é extremamente difícil usar o PCR através do ITR. Projetos de clonagem que requerem amplificação por PCR através de ITRs devem ser evitados e, adicionalmente, limitar o uso da técnica de clonagem de montagem Gibson. Como tal, a clonagem de enzimas de restrição é o método preferido para clonagem em plasmídeos contendo ITR. Além disso, certos primers para o sequenciamento de Sanger podem não ser compatíveis se a região sequenciada contiver o ITR. Em vez disso, recomenda-se o uso de primers que sequenciam longe dos ITRs e no corpo do genoma do vetor para obter resultados de sequenciamento mais precisos. Em segundo lugar, as ITRs são propensas a deleções, rearranjos e mutações quando transformadas em bactérias para amplificação de plasmídeos^32,33. Para mitigar esses eventos, recomenda-se o uso de cepas bacterianas competentes deficientes em recombinação, como Stbl3, e incubá-las a 30 °C para retardar as divisões celulares. Por fim, observou-se que colônias menores podem corresponder a clones sem rearranjos ou deleções, pois aquelas sem ITR podem conferir vantagem de crescimento e serem maiores. Portanto, recomenda-se escolher colônias que são pequenas.

Produção de vetores
A produção bem-sucedida do vetor rAAV pode ser afetada por múltiplos elementos. Um fator crítico é a saúde das células HEK293 ou 293T usadas para transfecção. Geralmente, baixos números de passagem são ideais, pois células altamente passadas podem exibir variações genotípicas e fenotípicas que podem reduzir os títulos de rAAV. Além disso, a densidade das células semeadas deve ser de 75%-90% de confluência para uma produção efetiva. Células esparsas geram baixos rendimentos vetoriais porque há menos células disponíveis para produzir vetores, enquanto células supercultivadas não serão eficientemente transfectadas.

Variações entre lotes de reagentes, estoques de células e variabilidade geral de laboratório para laboratório contribuem para diferenças nas eficiências de transfecção e títulos de produção. Um fator otimizável que pode levar a melhorias nos títulos é a razão plasmídeo:PEI nas reações de transfecção. É fundamental usar PEI MAX fresco (<1 mês de idade). Recomenda-se que uma relação plasmídeo:PEI de 1:1 seja usada como ponto de partida e, se a eficiência da transfecção ou transdução parecer baixa, teste várias razões diferentes. A otimização do título é mais fácil se usar um transgene com uma leitura visual, como o trangene do repórter CMV.Luc.IRES.EGFP usado aqui como material de partida para clonagem. Para realizar a otimização, siga o passo 3 do protocolo usando uma placa de 12 poços e reduzindo as massas plasmidiais e os volumes de reagentes em dois (a massa plasmidial final é de 2,6 μg). Ajustar o volume do PEI de acordo com as razões que variam de 1:0,75 a 1:3, com incrementos crescentes de 0,25 (Figura 6). Diluir cada reação com 950 μL de SF após 15 min. Por conveniência, uma mistura mestra contendo os plasmídeos triplos pode ser feita e pipetada individualmente em tubos de 1,5 mL antes de adicionar o PEI-ver Arquivo Suplementar 2. Colher o vetor, transduzir células de interesse e imagem. O poço com maior eficiência de transdução (proporção de células GFP+) corresponde ao título mais alto e à razão mais ótima de PEI:DNA.

Figura 6: Fluxo de trabalho de otimização PEI. Esquema das etapas necessárias para otimização do PEI. Múltiplas razões de plasmídeo: PEI são testadas para determinar a proporção ótima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Considerações sobre colheita e titulação
A técnica de congelamento/descongelamento utilizada para a colheita do vetor rAAV lisa efetivamente as células HEK293 de forma compatível com o uso direto do lisado clarificado para transduzir células cultivadas. Alguns sorotipos de rAAV, como AAV1, AAV8 e AAV9, são liberados das células durante a produção do vetor e podem ser colhidos do meio celular cultivado sem ciclos de congelamento/descongelamento³⁴. O método aqui descrito tipicamente produz títulos da ordem de 1 x 10 10 VG/mL quando se usa capsídeos AAV2 e 1 x^{10 11} VG/mL para AAV8. Embora títulos mais altos possam ser alcançados por detergente ou outra lise de base química, estes são prejudiciais para as células em uso a jusante e exigem que os rAAVs sejam purificados do lisado. O título mais baixo é uma compensação que um pesquisador deve considerar ao determinar se as preparações brutas são apropriadas para suas necessidades de pesquisa, no entanto, os títulos marginalmente mais baixos produzidos pelos métodos descritos aqui podem transduzir muitos tipos de células muito bem (ver resultados representativos). Além da eficiência da transfecção e da saúde celular, os títulos vetoriais variam dependendo do capsídeo utilizado durante a produção do rAAV e do tamanho e sequência do transgene dentro do VG³⁵.

Na colheita de preparações vetoriais brutas, o DNA plasmidial que foi usado durante a transfecção de plasmídios triplos pode estar presente e, embora raro, resultar em transfecção a jusante durante a transdução. Além disso, VGs não embalados podem se ligar ao exterior de capsídeos e invocar uma resposta imune inata ao DNA nu e estranho de fita simples^36,37. Portanto, tipos celulares sensíveis podem exigir que as preparações vetoriais sejam digeridas e purificadas para remover VGs e plasmídeos não embalados.

Se se deseja calcular o título de uma preparação bruta, qPCR pode ser realizada para quantificar o número de VG embalados dentro de partículas resistentes à DNase (DRP). Resumidamente, uma pequena quantidade de preparação bruta é digerida pela DNase para remover o DNA plasmidial, contaminando ácidos nucleicos ou VG parcialmente embalado. A amostra é então submetida à qPCR e o VG protegido dentro das DRPs é quantificado, resultando em um título com unidades do genoma do vetor por mL de preparação bruta³⁸. Não é recomendado realizar titulação vetorial usando ensaios baseados em ELISA que quantificam títulos de capsídeo. Em comparação com o vírus AAV selvagem, o rAAV sofre de uma proporção de capsídeos vazios e parcialmente embalados³⁹. O ELISA quantificará todos os capsídeos, independentemente do conteúdo do genoma, e superestimará as unidades transdutíveis presentes em uma preparação, o que requer um VG embalado.

Considerações sobre transdução
Muitos fatores influenciam as transduções de rAAV e considerações adequadas devem ser feitas para qualquer novo experimento. Dependendo do promotor que conduz a expressão transgênica, o início da expressão pode ocorrer já 4 h após a transdução (hpt), e o pico de expressão é tipicamente alcançado por 48 hpt. É importante ter em mente a duração do tempo desde a semeadura inicial das células até o desfecho experimental. Isso é para estimar a confluência inicial das células e garantir que elas não cresçam demais até o final do experimento. Se as células se tornam superconfluentes, o comportamento celular pode ser alterado devido a uma resposta ao estresse e pode confundir os resultados experimentais. Alguns tipos de células, como U2-OS, podem tolerar muito bem o crescimento excessivo/inibição de contato. Além disso, podem suportar longos períodos (48 h+) em meio condicionado sem soro – produto desse protocolo de produção. No entanto, tipos celulares sensíveis podem exigir adição de soro ou diluição da preparação bruta com meio de crescimento especial para manter a saúde durante a transdução. Uma eficiência de transdução ligeiramente reduzida do uso de meios contendo soro é uma compensação potencial para a saúde celular e deve ser considerada pelo pesquisador.

Normalmente, para células que se dividem rapidamente, uma confluência inicial de cerca de 50% é ideal para aplicações que serão terminadas 48 hpt. No entanto, a confluência pode ser ajustada de acordo com as necessidades do experimento. Não é recomendado transduzir linhagens celulares imortalizadas do tipo monocamada com mais de 75% de confluência devido à diminuição da eficiência de transdução. A maioria dos tipos celulares cultivados são transduzidos com sucesso e saudáveis após incubação noturna com preparações brutas de rAAV, seguidas por uma mudança para meios contendo soro fresco pela manhã.

O sorotipo do capsídeo é um fator importante a ser considerado na produção de rAAV para transduzir uma célula-alvo, uma vez que o capsídeo é o principal determinante do tropismo celular e subsequente expressão transgênica¹³. O AAV2 é um sorotipo amplamente utilizado devido à sua capacidade de transduzir efetivamente muitos tipos de células cultivadas¹². Essa propriedade do AAV2 pode ser atribuída aos proteoglicanos do sulfato de heparina (HSPGs) que servem como principal fator de ligação para AAV2 e aos altos níveis de HSPGs em células cultivadas desde a adaptação até o crescimento em uma placa⁴⁰. Outros capsídeos, como o AAV9, são menos eficazes na transdução de tipos celulares amplos e podem ser explicados por seus fatores de ligação de confiança que não são expressos nesse cenário⁴¹. Portanto, recomendamos o AAV2 como capsídeo de primeira escolha em células cultivadas se uma célula-alvo desejada não tiver sido previamente testada com rAAV na literatura.

Por favor, note que uma grande limitação das preparações vetoriais brutas é que elas são inadequadas para transdução de modelos animais. Estudos in vivo requerem que as preparações sejam purificadas e submetidas a avaliação de qualidade.

Considerações sobre expressão transgênica e potencial integração
Os rAAVs não resultam de forma confiável na expressão permanente do transgene. Com o tempo, os VGs podem se silenciar e a expressão transgênica pode ser interrompida após várias passagens⁴². Além disso, a maioria dos VGs permanece epissomal, e os rAAVs não contêm as proteínas Rep virais que mediariam a integração frequente no genoma do hospedeiro como em uma infecção lisogênica viral selvagem ou promoveriam a replicação de VGs⁴³. Como resultado, epissomos em células transduzidas serão eventualmente diluídos entre células filhas através de divisões.

A integração em nível basal é uma possibilidade para todo o material de DNA transgênico fornecido. No entanto, os VGs contendo ITR são propensos à integração em uma frequência mais alta⁴⁴. Portanto, a expressão permanente de um transgene pode ser observada em um pequeno subconjunto de células. Os usuários devem considerar essa possibilidade, especialmente quando se usa o rAAV para entregar enzimas cortantes de DNA, como Cas9, pois quebras de fita dupla podem resultar em uma frequência ainda maior de integração e expressão permanente⁴⁵. Embora isso torne o rAAV um bom candidato para fornecer modelos de reparo direcionado por homologia para marcação endógena ou adição de genes, a possibilidade de inserção de Cas9 deve ser considerada^19,46.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visualização de DNA Snapgene	sofrware Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40	AddGene	105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)	AddGene	104963
pAdΔ F6	AddGene	112867
LB Ágar Carbenicilina	Sigma-Aldrich	L0418
Boekel Incubadora Digital de Economia Científica	Boekel Scientific	133000
LB meio, pó	MP Biomedicals	113002042
Carpenicilina (Dissódico)	GoldBio	C-103-5
New Brunswick I26 Shaker	Eppendorf	M1324-0000
50 mL Tubos de Centrífuga	Corning	430828
Centrífuga 5810 R	Eppendorf	22627040
QIAGEN Plasmid Plus Kit Midi	Qiagen	12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS	USA Scientific	1402-3900
Mastercycler nexus	Eppendorf	6333000022
dNTP	Thermo Fisher Scientific	18427013
5x Phusion Buffer	NEB	B0518S	Fornecido com a compra da Phusion Polymerase
Phusion  Corante de carregamento de gel DNA polimerase	NEB	M0530S
, laranja (6X)	NEB	B7022S
DNA Clean & Concentrador-100	Zymo	D4029
Zymoclean Gel Kit de Recuperação de DNA	Zymo	D4001
NotI-HF	NEB	R3189S
EcoRI-HF	NEB	R3101S
CutSmart Buffer (10x)	NEB	B6004S	Fornecido com a compra da enzima de restrição
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500100
Brometo de Etídio	Sigma-Aldrich	E1510
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
T4 DNA Ligase Reação Buffer	NEB	B0202S	Fornecido com a compra de T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)	Eppendorf	22363204
Microprocessador de Precisão Banho-maria	Thermo Scientific	51221046
Tubos de Cultura de Plástico Estéril	Fisher Scientific	149566B
2.0 mL Tubo de Microcentrífuga	Thomas Scientific	1149Y01
ZR Plasmídeo Miniprep - Clássico	Zymo	D4015
Xma1	NEB	R0180S
Sma1	NEB	R0141S
HEK 293T células	ATCC	CRL-3216
Falcon 6-well	Corning	353046
Gibco  DMEM, glicose alta, piruvato	Thermo-Fisher	11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) Incubadora de CO2	Marshall Scientific	MCO-18AIC
PEI MAX (Cloridrato de Polietilenomina)	Polysciences	24765-100
Mixer Vortex Genie 2	Microscopia Eletrônica Sciences	102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer	Sanyo	14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 com janela transparente	VWR	390-0384
Microcentrífugas Eppendorf	Eppendorf	05-400-005
Camundongos Falcon 96 poços	Corning	353072
C57BL/6J Cepa		JAX #000664
meio de crescimento organoide	STEMCELL Technologies	6005
L Wnt-3A células	ATCC	CRL-2647
nicotinamida	Sigma	N0636-100G
inibidor	ROCK STEMCELL Technologies	72302
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72052
Corning Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (GFR) Membrana basal	Fisher	356231
placa de 24 poços	Fisher	08-772-1
D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-250
TrypLE Express	Fisher	12604013
DMEM/F-12 com 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies	36254
polybrene	Millipore Sigma	TR-1003-G
placas de 48 poços	Fisher	08-772-3D
Thermo Scientific  Nunc Lab-Tek Tampa de Vidro com Câmara	Fisher	12-565-470
Células BeWo	ATCC	CCL-98
F-12K Médio	ATCC	30-2004
Hepa1-6	ATCC	CRL-1830
Huh7	UC Berkeley BSD Cell Culture Facility	HUH-7
C2C12	ATCC	CRL-1772
HSkMC	ATCC	PCS-950-010
Meio de Crescimento de Células do Músculo Esquelético	Sigma	C-23060
Meio de Diferenciação do Músculo Esquelético	Sigma	C-23061
Invitrogen  Microscópio de Fluorescência Digital Colorido EVOS	Fisher Scientific	12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix	Perkin Elmer HH14001000
PhenoPlate 96-well	Perkin Elmer	6055302
DMEM, alta glicose, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Suplemento Thermo-Fisher	31053028
GlutaMAX	Thermo-Fisher	35050079
Piruvato de sódio	Thermo-Fisher	11360070
pAAV2 / 5 (Rep / Cap)	Addgene	104964
pAAV2 / 8 (Rep / Cap)	Addgene	112864
pAAV-DJ-N589X (Rep / Cap)	Addgene	130878
pAAV2 / 9n (Rep / Cap)	Addgene	112865
pAnc80L65AAP	Addgene	92307
KP1 (rep/cap)			doado pelo Professor Mark Kay (Universidade de Stanford)
LK03 (representante/cap)			doado pelo Professor Mark Kay (Universidade de Stanford)
pAAV4 (representante/cap)			doado pelo Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNA	Addgene	61591
pAAV.MCS	Addgene	46954
gBlock (fragmentação de DNA sintético)	IDT