Aqui, descrevemos protocolos para três tipos de culturas de explantes de pele embrionária aviária que podem ser usados para examinar interações teciduais, filme de lapso de tempo de imagem 4D (3D mais tempo), perturbação global ou local da função molecular e caracterização de biologia de sistemas.
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Artigo de método
Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pele aviária em desenvolvimento durante a embriogênese é um modelo único que pode fornecer informações valiosas sobre a padronização do tecido. Aqui, são descritas três variações nas culturas de explantes cutâneos para examinar diferentes aspectos do desenvolvimento da pele. Primeiro, culturas e manipulações de órgãos ex vivo oferecem aos pesquisadores oportunidades de observar e estudar diretamente o desenvolvimento de botões de penas. A cultura de explante cutâneo pode crescer por 7 dias, permitindo a análise direta do comportamento celular e imagens 4D em intervalos durante esse período de crescimento. Isso também permite manipulações físicas e moleculares das condições de cultura para visualizar a resposta do tecido. Por exemplo, contas revestidas com fator de crescimento podem ser aplicadas localmente para induzir mudanças no padrão de penas em uma área limitada. Alternativamente, a transdução viral pode ser entregue globalmente nos meios de cultura para aumentar ou diminuir a expressão gênica. Em segundo lugar, o protocolo de recombinação da pele permite que os pesquisadores investiguem as interações teciduais entre a epiderme e o mesênquima que são derivadas de diferentes regiões da pele, diferentes estágios de vida ou diferentes espécies. Isso oferece uma oportunidade de testar a janela de tempo na qual o epitélio é competente para responder a sinais e sua capacidade de formar diferentes apêndices cutâneos em resposta a sinais de diferentes fontes mesenquimais. Em terceiro lugar, a reconstituição da pele usando células dérmicas dissociadas revestidas com epitélio intacto redefine o desenvolvimento da pele e permite o estudo dos processos iniciais de padronização periódica. Essa abordagem também aumenta nossa capacidade de manipular a expressão gênica entre as células dissociadas antes de criar o explante de pele reconstituído. Este artigo fornece os três protocolos de cultura e experimentos exemplares para demonstrar sua utilidade.
Introdução
O desenvolvimento da pele do embrião aviário é um excelente modelo para estudar os mecanismos da morfogênese devido aos padrões distintos e à acessibilidade à microcirurgia e manipulação 1,2. No entanto, avaliar eventos celulares e moleculares em tecidos intactos pode ser difícil porque a presença de tecidos estranhos pode complicar as observações microscópicas. Além disso, a capacidade de manipular a expressão gênica para testar seu papel na morfogênese da pele nem sempre é uma tarefa simples. Descobrimos que podemos testar as funções dos genes usando transdução retroviral com uma taxa de sucesso mais alta us....
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Protocolo
1. Cultura de explante de pele de galinha (Figura 1)
- Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estabelecê-los de acordo com Hamburger e Hamilton14.
- No estágio 28 (~E5.5), o segundo dedo do membro e o terceiro dedo do pé são mais longos que os outros; três dígitos e quatro dedos são distintos.
- No estágio 29 (~E6), a asa é dobrada no cotovelo; O segundo dígito é distintamente mais longo do que os outros.
- No estágio 30 (~ E6.5), duas fileiras de botões de penas dorsais de cada lado da medula es....
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Resultados
Culturas de explante cutâneo
O desenvolvimento de botões de penas de culturas de órgãos da pele ex vivo pode ser observado diretamente ao microscópio. Usando o modelo de cultura de explante de pele da pele dorsal do estágio 30 de frango, os placódios são visíveis ao longo da linha média. A frente morfogenética então se propaga gradualmente lateralmente em direção à periferia da pele com a formação de novos primórdios de penas. Esses primórdios de penas se desenvolverão em botões de penas curt.......
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Discussão
A recombinação tecidual fornece um ensaio para explorar as contribuições únicas do epitélio e do mesênquima. Nas galinhas, as penas começam a se desenvolver no dia embrionário 7 (E7), enquanto as escamas começam no E9. Quando o mesênquima de escamas E9 é recombinado com o epitélio de penas E7, o tecido recombinado forma escamas, e quando o mesênquima de penas E7 é recombinado com o epitélio de escamas E9, as penas são formadas11. Esses estudos demonstraram que o mesênquima controla a formação de p.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo NIH NIAMS grant R37 AR 060306, R01 AR 047364 e RO1 AR078050. O trabalho também é apoiado por um contrato de pesquisa colaborativa entre a USC e a China Medical University em Taiwan. Agradecemos à turma de Biologia do Desenvolvimento 2023 da USC BISC 480 por testar com sucesso este protocolo de cultura de pele aviária durante vários módulos de laboratório.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prato de cultura de 6 poços | Falcon | REF 353502 | Culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) |
| Inserção de cultura de células | Falcão | REF 353090. | 0,4 µ Tipo transparente |
| de colagenase | bioquímico de Worthington | LS004196 | |
| Dulbecco' s Águia modificada' s médio | Corning | 10-013-CV | 4,5 g/L glicose |
| Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Soro bovino fetal | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks' s solução salina tamponada | Gibco | 14170-112 | Sem cálcio, sem magnésio |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15-140-122 | |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Cloreto de sódio (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Fosfato de sódio monobásico (NaH < sub > 2 < / sub > PO < sub > 4 < / sub >) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Tripsina | Gibco | 27250-042 |
Referências
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux,
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Reimpressões e permissões
