Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.
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Artigo de método
Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os lipídios são altamente diversos e pequenas mudanças nas estruturas e composição lipídicas podem ter efeitos profundos nas funções biológicas críticas. A marcação de isótopos estáveis (SIL) oferece várias vantagens para o estudo da distribuição, mobilização e metabolismo de lipídios, bem como para a síntese lipídica de novo . A implementação bem-sucedida da técnica SIL requer a remoção de interferências de moléculas endógenas. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de lipídios SIL de amostras biológicas; Serão mostrados exemplos de identificação de lipídios de novo durante o desenvolvimento do ovário do mosquito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa permite a separação e atribuição de lipídios de uma única amostra em uma única varredura (<1 h). A abordagem descrita aproveita os desenvolvimentos recentes na aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados, usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. A medição do SIL no nível da cadeia de ácidos graxos revela mudanças na dinâmica lipídica durante o desenvolvimento do ovário dos mosquitos. As estruturas lipídicas de novo são atribuídas com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.
Introdução
Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo 13C ou 2H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado1. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveni....
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Protocolo
1. Preparação da amostra
- Dissecção de insetos
- Dissecar os ovários do mosquito Aedes aegypti aos 7 dias de idade em solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas.
- Colete oito ovários da solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas e armazene em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a -80 ° C.
- Colete ovários em réplicas biológicas.
- Extração de lipídios
- Adicione 10 μL de padrão interno (ISTD) nos oito ovários coletados na concentração de 1 ppm. O ISTD é uma mistura lipídica marcada com sete deutério de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:....
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Resultados
A marcação de isótopos estáveis facilita a visualização de triglicerídeos em estudos de dinâmica lipídica de ovários de mosquitos fêmeas. No domínio da mobilidade 2D, o triglicerídeo 48:1 é exibido em uma região com um tempo de retenção específico em relação à mobilidade 1/K0. A intensidade do triglicerídeo pode ser visualizada por uma linha azul mais escura. Outras manchas representam triglicerídeos adicionais encontrados no ovário. Os tempos de retenção e mobilidades variam devido às diferenças de massas e e.......
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Discussão
Ao avaliar o uso deste protocolo, é essencial garantir que os parâmetros DIA-PASEF e MS/MS sejam aplicáveis aos triglicerídeos em questão. Especificamente, as janelas de mobilidade e a largura da janela devem seguir o padrão dos triglicerídeos. Isso pode ser determinado com uma execução anterior usando o método DDA. Ao rastrear os triglicerídeos no padrão interno, as janelas para a configuração do DIA devem cobrir todas as moléculas de interesse pré-identificadas. As janelas devem ser todas de tamanhos iguais e os interv.......
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Divulgações
Matthew Willetts e Melvin A. Park são funcionários da Bruker Daltonics Inc, fabricante do instrumento comercial timsTOF. Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.
Agradecimentos
Os autores gostam de reconhecer as contribuições do Dr. Cesar Ramirez durante o desenvolvimento inicial do método. Esta pesquisa foi financiada pelas bolsas NIAID R21AI167849 para FGN, projeto 22-21244S da Czech Science Foundation, República Tcheca para MN.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Análise de Dados | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Versão 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | ||
| tubos eppendorf | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| frascos de vidro | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| água pesada (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| pilões de polipropileno | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrarrápido cromatógrafo | Shimadzu | L20234651907 | |
| inserções de vidro silanizado | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | ||
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Padrão de Calibração de Mistura de Afinação | Agilent Technologies | 36 |
Referências
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al.
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Reimpressões e permissões
