La production hépatique de glucose, l’uréagénèse et la lipolyse quantifiées à l’aide du modèle de foie de souris perfusé

Summary

Nous présentons ici une méthode robuste de perfusion in situ du foie de souris pour étudier la régulation aiguë et directe du métabolisme hépatique sans perturber l’architecture hépatique mais en l’absence de facteurs extra-hépatiques.

Abstract

Le foie a de nombreuses fonctions, y compris le métabolisme des nutriments. Contrairement à d’autres modèles in vitro et in vivo de recherche hépatique, le foie perfusé isolé permet d’étudier la biologie et le métabolisme hépatique dans l’ensemble du foie avec une architecture hépatique intacte, séparée de l’influence de facteurs extra-hépatiques. Les perfusions hépatiques ont été développées à l’origine pour les rats, mais la méthode a également été adaptée aux souris. Nous décrivons ici un protocole de perfusion in situ du foie de souris. Le foie est perfusé antérograde à travers la veine porte avec un tampon bicarbonaté oxygéné de Krebs-Henseleit, et la sortie est recueillie à partir de la veine cave inférieure suprahépatique avec serrage de la veine cave inférieure infrahépatique pour fermer le circuit. À l’aide de cette méthode, les effets hépatiques directs d’un composé d’essai peuvent être évalués avec une résolution temporelle détaillée. La fonction hépatique et la viabilité sont stables pendant au moins 3 h, ce qui permet d’inclure des contrôles internes dans la même expérience. Les possibilités expérimentales à l’aide de ce modèle sont nombreuses et peuvent permettre de mieux comprendre la physiologie du foie et les maladies du foie.

Introduction

Le foie est un organe essentiel du métabolisme. Il joue un rôle clé dans le contrôle de l’équilibre énergétique de l’ensemble du corps en régulant le métabolisme du glucose, des lipides et des acides aminés. L’augmentation des maladies du foie dans le monde est en train de devenir un fardeau majeur pour la santé mondiale, et davantage de connaissances sont nécessaires sur la physiopathologie et ses conséquences sur les fonctions hépatiques.

Divers modèles in vitro ont été développés pour la recherche sur le foie afin de compléter les études in vivo. Les hépatocytes primaires isolés et cultivés chez les rongeurs et les humains sont largement utilisés. Les cellules non parenchymateuses peuvent être séparées des hépatocytes par centrifugation différentielle et par gradient, et la co-culture de différents types de cellules est utile pour étudier la diaphonie intercellulaire¹. Bien que les hépatocytes humains primaires soient considérés comme l’étalon-or pour tester la toxicité des médicaments, plusieurs études ont montré que les hépatocytes se dédifférencient rapidement dans la culture tissulaire, ce qui entraîne une perte des fonctions hépatiques ^2,3,4. La culture d’hépatocytes dans un système sphéroïde 3D améliore la dédifférenciation, est plus stable et semble imiter le foie in vivo à un degré plus élevé que les systèmes de culture 2D traditionnels⁵. Les tranches de foie découpées avec précision sont un autre modèle in vitro bien établi qui maintient l’architecture tissulaire intacte et contient les cellules non parenchymateuses présentes dans le foie⁶. Les modèles in vitro plus avancés comprennent le foie sur puce⁷ et les organoïdes hépatiques⁸. Cependant, avec toutes ces approches, il y a une perte d’intégrité structurelle et de dynamique de l’écoulement, y compris l’écoulement vectoriel de la veine porte-hépatique, ce qui a probablement un impact sur la généralisabilité.

Le foie de rat isolé a été décrit pour la première fois par Claude Bernard en 1855⁹, et est toujours utilisé dans divers domaines scientifiques pour l’étude de la biologie, de la toxicologie et de la physiopathologie du foie. Les avantages du foie perfusé par rapport aux modèles in vitro mentionnés ci-dessus comprennent le maintien de l’architecture hépatique, du flux vasculaire, de la polarité et de la zonation des hépatocytes, ainsi que des interactions entre les hépatocytes et les cellules non parenchymateuses. Par rapport aux études in vivo, le foie perfusé permet d’étudier le métabolisme hépatique de manière isolée en évitant les facteurs extra-hépatiques transportés par le sang et avec un contrôle complet des conditions expérimentales. Plusieurs modifications ont été apportées pour améliorer le modèle de perfusion hépatique de rat au cours des années^10,11,12,13. Bien que des souris aient été utilisées pour des études isolées sur le foie perfusé, moins de littérature est disponible. Nous présentons ici une méthode de perfusion in situ du foie de souris par canulation de la veine porte et de la veine cave suprahépatique inférieure afin d’étudier les réponses métaboliques aiguës et directes aux substrats métaboliques et aux hormones telles que mesurées dans l’effluent veineux hépatique du foie de souris en temps réel.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées avec l’autorisation de l’Inspection danoise de l’expérimentation animale, du ministère de l’Environnement et de l’Alimentation du Danemark (permis 2018-15-0201-01397) et du comité d’éthique local conformément à la directive européenne 2010/63/UE, aux National Institutes of Health (publication n° 85-3) et conformément aux directives de la législation danoise régissant l’expérimentation animale (1987). Il s’agit d’une procédure termina…

Representative Results

Une base de référence stable est nécessaire pour déterminer si un stimulus ou un substrat conduit à la libération de la molécule d’intérêt. La figure 3A montre un exemple d’expérience réussie. La production d’urée dans le foie perfusé est mesurée à des intervalles de 2 minutes et indiquée sous forme de moyenne ± MEB. Les périodes de référence précédant chacune des deux périodes de stimulation sont stables. La production moyenne d?…

Discussion

Le foie de souris perfusé isolé est un outil de recherche puissant pour l’étude de la dynamique et des mécanismes moléculaires du métabolisme hépatique. La possibilité de prélever des échantillons minute par minute permet d’évaluer en détail l’effet direct d’un composé d’essai sur le foie. Par rapport aux études de vivo, le foie perfusé permet d’étudier le métabolisme hépatique de manière isolée en évitant les facteurs extra-hépatiques transportés par le sang et avec une maîtr…