Producción hepática de glucosa, ureagénesis y lipólisis cuantificadas mediante el modelo de hígado de ratón perfundido

Summary

Aquí, presentamos un método robusto para la perfusión in situ del hígado de ratón para estudiar la regulación aguda y directa del metabolismo hepático sin alterar la arquitectura hepática pero en ausencia de factores extrahepáticos.

Abstract

El hígado tiene numerosas funciones, incluido el metabolismo de los nutrientes. A diferencia de otros modelos in vitro e in vivo de investigación hepática, el hígado perfundido aislado permite el estudio de la biología hepática y el metabolismo en todo el hígado con una arquitectura hepática intacta, separada de la influencia de factores extrahepáticos. Las perfusiones hepáticas se desarrollaron originalmente para ratas, pero el método también se ha adaptado a ratones. Aquí describimos un protocolo para la perfusión in situ del hígado de ratón. El hígado se perfunde antegrágradamente a través de la vena porta con tampón bicarbonato Krebs-Henseleit oxigenado, y la salida se recoge de la vena cava inferior suprahepática con pinzamiento de la vena cava inferior infrahepática para cerrar el circuito. Con este método, los efectos hepáticos directos de un compuesto problema pueden evaluarse con una resolución temporal detallada. La función hepática y la viabilidad son estables durante al menos 3 h, lo que permite la inclusión de controles internos en el mismo experimento. Las posibilidades experimentales que utilizan este modelo son numerosas y pueden inferir información sobre la fisiología hepática y las enfermedades hepáticas.

Introduction

El hígado es un órgano esencial en el metabolismo. Desempeña un papel clave en el control del equilibrio energético de todo el cuerpo mediante la regulación del metabolismo de la glucosa, los lípidos y los aminoácidos. El aumento de las enfermedades hepáticas en todo el mundo se está convirtiendo en una importante carga para la salud mundial, y se necesita más conocimiento sobre la fisiopatología y sus consecuencias para las funciones hepáticas.

Se han desarrollado varios modelos in vitro para la investigación en el hígado como complemento de los estudios in vivo. Los hepatocitos primarios aislados y cultivados de roedores y humanos son ampliamente utilizados. Las células no parenquimatosas se pueden separar de los hepatocitos mediante centrifugación diferencial y de gradiente, y el cocultivo de diferentes tipos celulares es útil para estudiar la diafonía intercelular¹. A pesar de que los hepatocitos humanos primarios se consideran el estándar de oro para probar la toxicidad de los fármacos, varios estudios han demostrado que los hepatocitos se desdiferencian rápidamente en el cultivo de tejidos, lo que resulta en la pérdida de las funciones hepáticas ^2,3,4. El cultivo de hepatocitos en un sistema esferoide 3D mejora la desdiferenciación, es más estable y parece imitar al hígado in vivo en un grado mayor que los sistemas de cultivo 2D tradicionales⁵. Los cortes de hígado cortados con precisión son otro modelo in vitro bien establecido que mantiene intacta la arquitectura del tejido y contiene las células no parenquimatosas presentes en el hígado⁶. Los modelos in vitro más avanzados incluyen el hígado en un chip⁷ y los organoides hepáticos⁸. Sin embargo, con todos estos enfoques, hay una pérdida de integridad estructural y dinámica de flujo, incluido el flujo vectorial de la vena portal-hepática, lo que probablemente afecte la generalización.

El hígado de rata perfundido aislado fue descrito por primera vez por Claude Bernard en 1855⁹, y todavía se utiliza en varios campos científicos para estudios de biología hepática, toxicología y fisiopatología. Las ventajas del hígado perfundido en comparación con los modelos in vitro mencionados anteriormente incluyen el mantenimiento de la arquitectura hepática, el flujo vascular, la polaridad y zonación de los hepatocitos, y las interacciones entre los hepatocitos y las células no parenquimatosas. En comparación con los estudios in vivo, el hígado perfundido permite el estudio del metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y con un control completo sobre las condiciones experimentales. A lo largo de los años se han realizado varias modificaciones para mejorar el modelo de perfusión hepática de rata 10,11,12,13. Aunque se han utilizado ratones para estudios de hígado perfundido aislado, hay menos bibliografía disponible. Aquí, presentamos un método para la perfusión in situ del hígado de ratón mediante canulación de la vena porta y la vena cava suprahepática inferior para estudiar las respuestas metabólicas agudas y directas a sustratos metabólicos y hormonas medidas en el efluente venoso hepático del hígado de ratón en tiempo real.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentos con Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca (permiso 2018-15-0201-01397) y el comité de ética local de acuerdo con la directiva de la UE 2010/63/UE, los Institutos Nacionales de Salud (publicación n.º 85-3) y siguiendo las directrices de la legislación danesa que rige la experimentación con animales (1987). Se trata de un procedimiento terminal, y la causa de la muerte es la exa…

Representative Results

Se requiere una línea de base estable para determinar si un estímulo o sustrato conduce a la liberación de la molécula de interés. La figura 3A muestra un ejemplo de un experimento exitoso. La producción de urea en el hígado perfundido se mide en intervalos de 2 minutos y se muestra como media ± SEM. Los períodos de referencia que preceden a cada uno de los dos períodos de estimulación son constantes. La producción media de urea durante los dos pe…

Discussion

El hígado de ratón aislado y perfundido es una herramienta de investigación sólida para el estudio de la dinámica y los mecanismos moleculares del metabolismo hepático. La posibilidad de recoger muestras minuto a minuto proporciona una evaluación detallada del efecto directo de un compuesto problema en el hígado. En comparación con los estudios de vivo, el hígado perfundido nos permite estudiar el metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y co…