Undersøgelsen beskriver en enkel, hurtig og delvist automatiseret protokol til isolering af kerner af høj kvalitet fra frosne pattedyrvæv til nedstrøms RNA-sekventering af enkeltkerner.
Enkeltcelle- og enkeltkerne-RNA-sekventering er blevet almindelige laboratorieapplikationer på grund af det væld af transkriptomisk information, de giver. Enkeltkerne RNA-sekventering er især nyttig til undersøgelse af genekspression i vanskeligt dissocierede væv. Desuden er denne tilgang også kompatibel med frosset (arkiveret) materiale. Her beskriver vi en protokol til isolering af enkeltkerner af høj kvalitet fra frosne pattedyrvæv til nedstrøms enkeltkerne-RNA-sekventering på en delvist automatiseret måde ved hjælp af kommercielt tilgængelige instrumenter og reagenser. Specifikt bruges en robotdissociator til at automatisere og standardisere vævshomogenisering efterfulgt af en optimeret kemisk gradient til filtrering af kernerne. Endelig tæller vi kernerne nøjagtigt og automatisk ved hjælp af en automatiseret fluorescerende celletæller. Udførelsen af denne protokol er demonstreret på musehjerne, rottenyre og cynomolgus lever og miltvæv. Denne protokol er ligetil, hurtig og let at tilpasse til forskellige pattedyrvæv uden at kræve omfattende optimering og giver kerner af god kvalitet til nedstrøms RNA-sekventering med enkelte kerner.
Enkeltcelle (sc) og enkeltkerne (sn) RNA-sekventering er blevet almindeligt anvendte protokoller inden for molekylær og cellulær biologi på grund af den øgede opløsning af genekspression sammenlignet med bulk RNA-sekventering. Imidlertid er isolering af enkeltcelle- og enkeltkernepræparater af god kvalitet fra fast væv fortsat en udfordring og er ofte det hastighedsbegrænsende trin i sc / sn-RNAseq-eksperimenter. Faktisk er der udviklet en overflod af protokoller, der bruger forskellige kemiske og mekaniske procedurer til at opnå celle / kerner suspensioner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Desuden spænder strategier til at rense sådanne præparater fra snavs / klumper osv. Fra flowsortering til filtrering til vask. Sådanne protokoller er ofte manuelle (hvilket fører til brugerrelateret variabilitet), kan være tidskrævende (hvilket fører til reduceret celle-/kernelevedygtighed) og/eller kan kræve adgang til et flowcytometer til celle/kerne-sortering. Denne undersøgelse fokuserede på at udvikle en enkel, hurtig og delvist automatiseret enkeltkerneisoleringsprotokol fra frosne pattedyrvæv til nedstrøms RNA-sekventeringsapplikationer. Vi fokuserede specifikt på kerneisolering i modsætning til celleisolering, da det er kompatibelt med brugen af frosset væv, hvilket gør prøveindsamling/-behandling mere praktisk og muliggør upartisk batching af prøver, især i tidsforløbseksperimenter. Selvom det nukleare transkriptom ikke fuldt ud afspejler det cellulære transkriptom, har flere undersøgelser nu vist, at enkeltkerner RNA-sekventeringsdata er sammenlignelige med enkeltcelle RNA-sekventeringsdata til celletypeidentifikation, selvom proportionerne af celletyper kan variere 6,16,17,18,19.
Kerneisolering består af flere trin: 1) mekanisk eller kemisk forstyrrelse af vævet for at frigive kernerne, 2) oprydning af snavs og klumper og 3) nøjagtig tælling af kerner til forberedelse til downstream-applikationer. I en række protokoller involverer trin 1 ofte brugen af en Dounce-homogenisator for at forstyrre vævet 3,20. Alternativt kan kemiske metoder anvendes, selvom disse ofte skal optimeres til forskellige væv 2,5,6. Vi har erfaret, at en manuel vævsforstyrrelsesprocedure er tilbøjelig til operatørassocieret variabilitet, hvilket fører til variabel kvalitet og udbytte af kerner. For at minimere teknisk variabilitet og for at få en mere konsistent og reproducerbar protokol, der fungerer på tværs af væv, blev der udviklet en protokol, der bruger en kommercielt tilgængelig robotvævsdissociator21. For trin 2, selvom bufferudveksling normalt er det enkleste middel til vask af kerner, vedtog vi brugen af et relativt kort centrifugeringstrin med saccharosegradient for at få en mere grundig fjernelse af snavs. Specifikt til hjernevæv bruger vi en silicakolloidgradient i stedet for en saccharosegradient for mere effektiv myelinfjernelse. Endelig er brugen af et hæmocytometer til tælling guldstandarden til tælling og visuel inspektion af kernerne. I vores protokol kan dette trin pålideligt automatiseres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig automatiseret fluorescerende celletæller22. Denne protokol er blevet testet og er kompatibel med flere frosne pattedyrvæv, herunder hjerne, nyre, milt og lever, fra forskellige pattedyrarter (rotte, mus og ikke-menneskelig primat) og giver kerner af god kvalitet til nedstrøms RNA-sekventering med enkelte kerner med en dråbebaseret kommerciel platform. Protokollen tager ca. 75 minutter fra vævsforberedelse til starten af RNA-sekventeringsarbejdsgangen med enkelte kerner.
Vi har udviklet en alsidig og delvist automatiseret protokol til opnåelse af enkeltkerner af høj kvalitet fra frosne pattedyrvæv og demonstreret protokollen på musehjerne, rottenyre og cynomolguslever og miltvæv.
Når vi sammenligner udførelsen af denne protokol med andre offentliggjorte protokoller for enkeltkerne RNA-sekventering i hjerne, nyre, milt og levervæv 6,7,20,24,25,26, observerer vi, at vi er i stand til at detektere et tilsvarende antal gener og UMI-tal pr. kerne og er i stand til at gendanne de forventede celletyper. Sammenlignet med eksisterende metoder er der flere fordele ved denne protokol. For det første automatiserer protokollen i denne undersøgelse vævshomogenisering og isolering af enkeltkerner. Dette opnås ved hjælp af en robotvævsforstyrrende faktor21. I de fleste protokoller homogeniseres væv med en Dounce-homogenisator for at frigøre enkeltkerner 3,20. Vi har imidlertid bemærket, at dette manuelle trin kan føre til eksperimentel variabilitet i kerneudbytte og integritet afhængigt af mængden af kraft, der udøves under homogenisering, hvilket kompromitterer eksperimenternes reproducerbarhed. Her blev der ved hjælp af en automatiseret vævssliber med faste indstillinger opnået god kernekvalitet og udbytte med større konsistens på tværs af forsøg. Desuden reducerer automatisering af dette trin også protokollens praktiske tid (vævsforstyrrelsestrinnet tager ca. 7 minutter), så brugeren kan forberede sig på de efterfølgende trin. For det andet er protokollen beskrevet i denne undersøgelse alsidig, dvs. den er kompatibel med forskellige væv fra forskellige arter. Dette gør det muligt for os at undgå langvarig protokoloptimering, f.eks. til at identificere homogeniseringsbuffere/vaskemidler til forskellige væv 2,5,6. For det tredje afhænger denne protokol ikke af adgang til en flowsorterer for at opnå rene kerner, hvilket gør den mere tilgængelig for laboratorier, der ikke har det nødvendige udstyr/ekspertise til flowsortering. I stedet optimerede vi den saccharosegradientbaserede filtrering for at fjerne det meste af affaldet. Men især for hjernevæv anbefales det at bruge en silicakolloidgradient i stedet for en saccharosegradient til mere effektiv myelinfjernelse. Vi har også fundet ud af, at brugen af en svingende skovlrotor i slutningen af centrifugeringstrinnet med saccharose/silicakolloidgradient minimerer kernetabet. Derfor anbefales brugen af en sådan rotor stærkt. For det fjerde, efter at have testet flere metoder til at tælle kerner (manuel tælling under mikroskopet, brug af flere automatiserede tællere), anbefales brugen af en automatiseret fluorescerende celletæller22. Anvendelsen af et DNA-interkalerende farvestof, såsom propidiumiodid, øger nøjagtigheden af kernetælling. For det femte tager denne protokol cirka 75 minutter fra start til indlæsning af den mikrofluidiske chip. Dette hjælper med at sikre, at kerneintegriteten forbliver høj, når der behandles flere prøver. Endelig har vi fundet, at protokollen også er kompatibel med optimalt skæretemperatursammensat (OCT)-indlejret væv. Hvis der anvendes sådant materiale, kan vævet fjernes fra OCT-blokken ved hjælp af en skalpel før homogenisering.
En hyppig udfordring i enkeltkerner RNA-sekventeringsdatasæt er tilstedeværelsen af omgivende RNA, som kan være ikke-nuklear (f.eks. Mitokondrie) såvel som nuklear afledt27,28. I vores protokol er mitokondrie-RNA (en proxy for ikke-nukleært omgivende RNA) lavt, selv før filtrering (0,1-1,6% for det viste væv). I lighed med andre protokoller og datasæt er omgivende RNA-forurening fra stærkt udtrykte gener i kernerne i rigelige celletyper (såsom hepatocytter i leveren, neuroner i hjerner osv.) stadig til stede27. Der findes flere bioinformatikværktøjer, såsom CellBender, SoupX osv., Der kan fjerne sådan omgivende RNA-forurening før kerneannotation 29,30,31. En anden begrænsning af denne protokol er, at selvom vævsforstyrrelses- og kerneisoleringstrinnene er automatiserede, er gennemstrømningen af dette trin stadig begrænsende, da kun en prøve kan behandles ad gangen. Men da dette trin kun tager ca. 7 minutter pr. stykke væv, kan flere prøver stadig behandles i en batch. Vi behandler typisk fire prøver pr. batch, men har lavet op til seks prøver pr. batch med gode resultater. Nylige forbedringer i robotdissociatoren for at muliggøre parallel behandling af to prøver samtidigt vil muliggøre behandling af 8-12 prøver pr. Batch, hvilket er kompatibelt med gennemstrømningen af den mikrofluidiske chip, der bruges til indkapsling af enkeltkerner.
Selvom vi ikke har brugt kernerne isoleret af denne protokol til andre downstream-applikationer såsom ATAC-seq eller snRNAseq ved hjælp af andre platforme, baseret på kvaliteten af data opnået med de genekspressionsreagenser, der anvendes her, mener vi, at vores protokol skal være kompatibel med yderligere downstream-applikationer. Det fremtidige arbejde vil dog indebære afprøvning af denne protokol med andre downstream-applikationer, såsom ATAC-seq.
Afslutningsvis har vi udviklet en hurtig, enkel og delvist automatiseret kerneisoleringsprotokol til nedstrøms RNA-sekventering med en enkelt kerne, der har vist sig at være kompatibel med forskellige typer frosset pattedyrvæv.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble og Matthias Selhausen for at levere det dyrevæv, der blev analyseret i dette manuskript. Vi vil også gerne takke Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki og Martin Ebeling for deres bioinformatikstøtte.
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |