Здесь мы представляем протокол для выделения и идентификации клеток лимбальной ниши человека.
Здесь мы сообщаем о стандартной процедуре выделения и идентификации клеток лимбальной ниши (LNCs). Ткань лимбуса, полученная из глазного банка, использовалась для выделения LNCs. Ткань делили на 12 частей в асептических условиях и переваривали в течение 18 ч при 37 °С в инкубаторе клеточных культур с использованием коллагеназы А для получения клеточных кластеров с LNC и клетками-предшественниками лимбального эпителия. Клеточные кластеры дополнительно расщепляли в течение 15 мин при 37 °C с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА для получения единичных клеток, а затем культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) на пластиковой поверхности, покрытой 5% Матригелем. Клетки пассажировали при слиянии 70%, а LNC идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции, количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) и проточной цитометрии. Первичные ЛНК были изолированы и пассированы более 12 раз. Пролиферационная активность ЛНК от Р4 до Р6 была самой высокой. LNC экспрессировали более высокие маркеры стволовых клеток, чем BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR и PDGFRβ). Кроме того, результаты показали, что P4 LNC равномерно экспрессируют VIM, CD90, CD105 и PDGFRβ, но не Pan-CK, который может быть использован в качестве маркера для идентификации LNC. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 95%, 97%, 92% и 11% LNC экспрессировали CD73, CD90, CD105 и SCF соответственно, в то время как в BMMSC они составляли 68%, 99%, 20% и 3%. Стандартный процесс выделения и идентификации LNC может обеспечить надежную лабораторную основу для широкого использования LNC.
Заболеваемость дефицитом эпителиальных стволовых клеток роговицы (CESD), также называемая дефицитом лимбальных стволовых клеток (LSCD)1, и регенерация эпителия роговицы (CES) становятся все более и более актуальными из-за инфекции и травмы роговицы. При отсутствии надлежащего лечения CESD может привести к слепоте, которая требует пересадки роговицы. В результате, регенерация CES становится все более значимой. Существует группа поддерживающих клеток, называемых клетками лимбальной ниши (LNC), которые обеспечивают необходимую поддержку функции CES. Лимбальные стромальные стволовые клетки были впервые выделены Polisetty et al.2 и идентифицированы Xie et al.3 как LNC, которые локализуются в лимбальном эпителии и строме лимба. LNC являются ключевыми поддерживающими стволовыми клетками края роговицы и, выполняя функцию МСК костного мозга (BMMSC), могут развиваться в эпителиальные клетки роговицы и стромальные клетки роговицы и т. д.3,4,5,6,7. Предыдущие исследования показали, что свойства стволовых клеток LNC более примитивны, чем BMMSC8, которые уже широко используются в клинике. ЛНК могут даже стать следующим жизнеспособным вариантом после МСК, особенно для лечения КЭСР. Являясь важными опорными клетками для CES, LNC также являются стволовыми клетками, полученными из «нишевой» структуры лимба. LNC могут играть ключевую роль в дедифференцировке зрелых эпителиальных клеток роговицы (MCEC) до CES9. Тем не менее, исследования ЛНК все еще относительно недостаточны, и нет единого мнения о терминологии, изоляции, очистке, идентификации и характеристиках ЛНК. Некоторые исследователи называют LNC стромальными стволовыми клетками, полученными в результате лимбальной биопсии 10, лимбальными мезенхимальными стволовыми клетками 11, лимбальными стволовыми клетками фибробластов12 и лимбальными мезенхимальными стромальными клетками13. Поскольку характеристики роста LNC не были подробно описаны, а также из-за их многообещающего научного и клинического применения, и они могут стать одним из наиболее важных клинических инструментов в будущем, необходимо обобщить выделение, очистку, идентификацию и характеристики LNC.
Согласно предыдущему исследованию14, ЛНК в основном присутствуют в лимбальном эпителии и строме лимба. Этот протокол включает в себя обработку тканей лимба с помощью коллагеназы А, получение кластера, состоящего из LEPC и LNCs, и расщепление его на отдельные клетки с 0,25% трипсин-ЭДТА (ТЭ). Затем LNC селективно культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) для очистки. Протокол, описанный в этой статье, прост и обладает высокой эффективностью в получении человеческих LNC в больших количествах.
Подробная процедура выделения, культивирования и идентификации LNC была записана в видео для ученых, заинтересованных в изучении LNC, и при необходимости ее можно удобно повторить.
Прозрачность роговицы обычно поддерживается за счет регулярного расположения и распределения мелких волокон (25-30 нм в диаметре) в строме роговицы, что имеет решающее значение для нормальной остроты зрения16. В мире насчитывается 253 миллиона людей с нарушениями зрения, 36 мил…
The authors have nothing to disclose.
Благодарим Вэй Вана, Линцзюань Сюя и Жун Лю за руководство этой работой, Юнъяо Тана, Бихуэй Цзиня, Чуньсю Ю и Ли Гуйгана за предоставление некоторых материалов, Гуаньюй Су за написание рукописи, Сяо Чжоу, Ихун Сюна и Хуатао Се за исправление рукописи, а также Гуйгана Ли за его полное руководство. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (No 82070936, 81470606, 81570819), научно-исследовательским проектом по здравоохранению и планированию семьи провинции Хубэй (No . WJ2017M073), Десять лучших трансляционных медицинских исследовательских проектов больницы Тунцзи (No 2016ZHYX20), Проект по обучению молодых пионеров медицины в городе Ухань (No 2015whzqnyxggrc10), Глобальная программа набора талантов (G2022154028L), проект Национальной комиссии по здравоохранению провинции Хубэй в 2022 году (WJ2021ZH0005) и Фонд предметного строительства финансового департамента провинции Хубэй в 2022 году(42000022815T000000102)
4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |