Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e identificar as células do nicho limbal humano.

Resumo

Relatamos aqui um procedimento padrão para o isolamento e identificação de células de nicho limbal (LNCs). Tecido do limbo obtido de um banco de olhos foi utilizado para o isolamento dos NCN. O tecido foi dividido em 12 pedaços sob condições assépticas e digerido por 18 h a 37 °C em incubadora de cultura celular usando colagenase A para obter aglomerados celulares com CNLS e células progenitoras epiteliais límbicas. Os aglomerados celulares foram posteriormente digeridos por 15 min a 37 °C usando tripsina-EDTA a 0,25% para obtenção de células únicas e, em seguida, cultivados em meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) em uma superfície plástica revestida com Matrigel a 5%. As células foram passadas em confluência de 70%, e os LNCs foram identificados por imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e citometria de fluxo. Os NCL primários foram isolados e passados mais de 12 vezes. A atividade proliferativa de LNCs de P4 a P6 foi a mais alta. Os LNCs expressaram marcadores de células-tronco mais elevados do que os BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Além disso, os resultados mostraram que os LNCs P4 expressaram uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, mas não Pan-CK, o que poderia ser usado como um marcador para a identificação de LNCs. A análise por citometria de fluxo mostrou que aproximadamente 95%, 97%, 92% e 11% dos LNCs expressaram CD73, CD90, CD105 e SCF, respectivamente, enquanto foram 68%, 99%, 20% e 3% nos BMMSCs. O processo padrão para isolamento e identificação de LNC poderia fornecer uma base laboratorial confiável para o uso generalizado de LNCs.

Introdução

A incidência de deficiência de células-tronco epiteliais corneanas (CESD), também chamada de deficiência de células-tronco do limbo (LSCD)¹, e regeneração epitelial corneana (ECC) estão se tornando cada vez mais urgentes devido à infecção e lesão corneana. Se não tratada adequadamente, a CESD pode levar à cegueira que requer transplante de córnea. Como resultado, a regeneração da CES está se tornando mais significativa. Existe um grupo de células de suporte chamadas células de nicho limbal (LNCs) que fornecem suporte essencial para a função da CES. As células-tronco estromais do limbo foram primeiramente isoladas por Polisetty et

Protocolo

O tecido do limbo de doadores com idade entre 50 e 60 anos foi obtido do Banco de Olhos da Cruz Vermelha, Hospital Tongji (Wuhan, China). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Tongji e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque.

1. Isolamento

1. Obter tecido do limbo a partir de meio de armazenamento corneano de médio prazo intermediário e operar sob condições assépticas em uma bancada de trabalho ultralimpa.
2. Raspar e remover a íris e o endotélio ao redor da córnea usando uma lâmina redonda cirúrgica estéril.
3. Cortar o tecido do limbo em doze pedaços de tamanho igual com uma l....

Resultados

Crescimento do LNC
Os NCL foram isolados com sucesso de acordo com o método de digestão da colagenase A (2 mg/mL) do tecido da borda corneoescleral, conforme descrito acima (Figura 1). Consistente com um estudo relatado anteriormente³, após a digestão da colagenase A, aglomerados semelhantes a lagartas foram visualizados ao microscópio (Figura 2). A proporção de células fusiformes aumentou gradualmente com a passagem c.......

Discussão

A transparência corneana é tipicamente mantida pelo arranjo e distribuição regulares de pequenas fibras (25-30 nm de diâmetro) no estroma corneano, o que é crucial para a acuidade visual normal¹⁶. Existem 253 milhões de deficientes visuais em todo o mundo, dos quais 36 milhões são cegos¹⁷. A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera a cegueira corneana um dos mais sérios agravos à visão humana, sendo responsável por 5,1% de toda a cegueira no mundo¹⁶

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4',6-Diamidino-2-Fenylindole	ThermoFisher	D1306	5μ g / mL
de anfotericina B	Sigma	V900919	1,25 μ g/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Albumina de Soro Bovino	MERCK	A1933-CD105
	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Incubadora de Células	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Sistema de centrífuga	StatSpin	StatSpin CytoFuge	12-Collagenase
A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Microscópio confocal	Zeiss	LSM700-Placa	de
cultura	3500356		35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) de burro	ThermoFisher	A16016	1:1000
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de burro	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Software Diva BD	Biosciences	Tree	Star-Flow
Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Microscópio de fluorescência	olympus	cx31
Gentamicina	Sigma	G1914	50 μ Hemocitômetro g/mL
	MERCK	Z359629	Kit de
Transcrição de cDNA de Alta Capacidade	Bright-Line ThermoFisher	4374966
Microscópio de contraste de fase invertida	UOP	DSZ2000X
ITS (insulina, transferrina, selenito de sódio)	Sigma	I3146	5 μ g/mL de insulina, 5 μ g/mL de transferrina, 5 ng/mL de selenito de sódio
KnockOut SR Substituição de soro para ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat
356234-Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldeído	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldeído	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real	Applied Biosystems	Step One
Plus-Recombinante Humano FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Fator Inibidor de Leucemia Humana(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini Kit de Isolamento de RNA	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Estereomicroscópio	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Lâmina redonda cirúrgica estéril	Careforde	29500	tamanho 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0,20%
Trypan azul	ThermoFisher	15250061	0,40%
Tripsina-EDTA	Genview	GP3108	0,25%
Tween 20	MERCK	P9416-Ultra
Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100