गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित हार्ड कोरल नमूनों के लक्षित मेटाबोलॉमिक्स
Summary
यहां, हम गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए कोरल होलोबियोनेट से ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण और तैयारी के साथ-साथ अलग कोरल होस्ट ऊतक और सिम्बियोडिनेसी सेल अंशों को प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) -आधारित दृष्टिकोण सीनिडेरियन-डिनोफ्लैगलेट सिम्बायोसिस के चयापचय आधार को स्पष्ट करने के लिए शक्तिशाली साबित हुए हैं और कोरल तनाव का जवाब कैसे देता है (यानी, तापमान-प्रेरित विरंजन के दौरान)। कोरल होलोबियोनेट की स्थिर-राज्य मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग, जिसमें निडारियन होस्ट और इसके संबंधित रोगाणु (सिम्बियोडिनेसी और अन्य प्रोटिस्ट, बैक्टीरिया, आर्किया, कवक और वायरस) शामिल हैं, कोरल की समग्र चयापचय स्थिति को चिह्नित करने के लिए परिवेश और तनाव की स्थिति के तहत सफलतापूर्वक लागू किया गया है।
हालांकि, सहजीवी इंटरैक्शन के आसपास के सवालों के जवाब देने के लिए, कोरल होस्ट और उसके अल्गल सिम्बियोट्स के मेटाबोलाइट प्रोफाइल का स्वतंत्र रूप से विश्लेषण करना आवश्यक है, जिसे केवल ऊतकों के भौतिक पृथक्करण और अलगाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, इसके बाद स्वतंत्र निष्कर्षण और विश्लेषण। जबकि मेटाबोलॉमिक्स का अनुप्रयोग कोरल क्षेत्र के लिए अपेक्षाकृत नया है, अनुसंधान समूहों के निरंतर प्रयासों के परिणामस्वरूप कोरल में मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए मजबूत तरीकों का विकास हुआ है, जिसमें कोरल होस्ट ऊतक और अल्गल सिम्बियोट्स का पृथक्करण शामिल है।
यह पेपर होलोबियोन्ट पृथक्करण और जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत करता है, जिसमें विचार के लिए प्रमुख अनुकूलन चरण शामिल हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे, एक बार स्वतंत्र रूप से विश्लेषण करने के बाद, दो अंशों (कोरल और सिम्बियोडिनियासी) का संयुक्त मेटाबोलाइट प्रोफाइल पूरे (होलोबियोन्ट) के प्रोफाइल के समान है, लेकिन ऊतकों को अलग करके, हम दो भागीदारों के बीच चयापचय और बातचीत के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी भी प्राप्त कर सकते हैं जो अकेले पूरे से प्राप्त नहीं की जा सकती है।
Introduction
मेटाबोलाइट्स सेलुलर प्रक्रियाओं के अंतिम उत्पादों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मेटाबोलॉमिक्स – किसी दिए गए जीव या पारिस्थितिकी तंत्र द्वारा उत्पादित मेटाबोलाइट्स के सूट का अध्ययन –जीव के कामकाज का प्रत्यक्ष माप प्रदान कर सकता है। यह पारिस्थितिक तंत्र, सहजीवी इंटरैक्शन और बहाली उपकरणों की खोज के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि अधिकांश प्रबंधन रणनीतियों का लक्ष्य विशिष्ट पारिस्थितिकी तंत्रसेवा कार्यों को संरक्षित (या पुनर्स्थापित) करना है। कोरल रीफ्स एक जलीय पारिस्थितिकी तंत्र है जो सहजीवी बातचीत को स्पष्ट करने और समुदाय-स्तर और पारिस्थितिकी तंत्र-स्तरके प्रभावों के लिए कोरल शारीरिक प्रतिक्रियाओं को जोड़ने के लिए मेटाबोलॉमिक्स के संभावित मूल्य को प्रदर्शित करता है। उच्च-थ्रूपुट गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) का आवेदन विशेष रूप से उच्च चयनात्मकता और संवेदनशीलता के साथ मेटाबोलाइट वर्गों की एक विस्तृत श्रृंखला का तेजी से विश्लेषण करने की क्षमता के कारण मूल्यवान है, वर्णक्रमीय पुस्तकालय उपलब्ध होने पर तेजी से यौगिक पहचान प्रदान करता है, और प्रति नमूना अपेक्षाकृत कम लागत के साथ उच्च स्तर की प्रजनन क्षमता और सटीकता प्रदान करता है।
कोरल होलोबियोन्ट्स हैं जिनमें कोरल जानवर, प्रकाश संश्लेषक डाइनोफ्लैगलेट एंडोसिम्बियोन्ट्स (परिवार: सिम्बियोडिनियासी4), और एक जटिल माइक्रोबायोम 5,6 शामिल हैं। कुल मिलाकर, होलोबियोन्ट की फिटनेस को मुख्य रूप से छोटे अणुओं और तत्वों के आदान-प्रदान के माध्यम से बनाए रखा जाता है ताकि प्रत्येक सदस्यके चयापचय कामकाज का समर्थन किया जा सके। मेटाबोलिक दृष्टिकोण सहजीवन विशिष्टता 9,11 के चयापचय आधार को स्पष्ट करने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली साबित हुए हैं, थर्मल तनाव के लिए विरंजन प्रतिक्रिया 7,8,12,13, रोग प्रतिक्रियाएं 14, प्रदूषण जोखिम प्रतिक्रियाएं15, फोटोक्लीमेशन 16, और कोरल में रासायनिक सिग्नलिंग 17, साथ ही बायोमार्कर खोज 18 में सहायता करती हैं।, 19. इसके अतिरिक्त, मेटाबोलॉमिक्स डीएनए- और आरएनए-आधारित तकनीकों 9,20 से अनुमानित निष्कर्षों की मूल्यवान पुष्टि प्रदान कर सकता है। इसलिए, रीफ स्वास्थ्य का आकलन करने और रीफसंरक्षण के लिए उपकरण विकसित करने के लिए मेटाबोलॉमिक्स के उपयोग के लिए काफी संभावना है, जैसे कि तनाव18,19 के चयापचय बायोमार्कर का पता लगाने के माध्यम से और पोषण सब्सिडी21 जैसी सक्रिय प्रबंधन रणनीतियों की क्षमता की जांच करने के लिए।
मेजबान और सिम्बियोनेट कोशिकाओं को अलग करना और होलोबियोनेट के रूप में एक साथ होने के बजाय स्वतंत्र रूप से उनके मेटाबोलाइट प्रोफाइल का विश्लेषण करना, साथी इंटरैक्शन, स्वतंत्र शारीरिक और चयापचय स्थिति और अनुकूलन के लिए संभावित आणविक तंत्र 11,12,22,23,24 के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकता है।. कोरल और सिम्बियोडिनियासी को अलग किए बिना, जटिल जीनोम पुनर्निर्माण और चयापचय मॉडलिंग25 को छोड़कर, कोरल और / या सिम्बियोडिनेशिया के योगदान और चयापचय को स्वतंत्र रूप से स्पष्ट करना लगभग असंभव है, लेकिन इसे कोरल-डिनोफ्लैगलेट सिम्बायोसिस पर लागू किया जाना बाकी है। इसके अलावा, होलोबियोनेट के मेटाबोलाइट प्रोफाइल से मेजबान या अल्गल सिम्बियोनेट के व्यक्तिगत चयापचय के बारे में जानकारी निकालने का प्रयास गलत व्याख्या का कारण बन सकता है।
उदाहरण के लिए, हाल तक, कोरल और होलोबियोनेट ऊतकों के अर्क में सी 18: 3 एन -6, सी 18: 4 एन -3, और सी 16 पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड की उपस्थिति को अल्गल सिम्बियोनेट से प्राप्त माना जाता था, क्योंकि कोरल को ओमेगा -3 फैटी एसिड के उत्पादन के लिए आवश्यक एक्स डिसैट्यूरेज़ नहीं माना जाता था; हालांकि, हाल के जीनोमिक साक्ष्य से पता चलता है कि कई सीनिडारियन में 3 पीयूएफए डी नोवो का उत्पादन करने और आगे बायोसिंथेसाइज़ करने की क्षमता होतीहै। स्थिर आइसोटोपिक लेबलिंग (जैसे, 13 सी-बाइकार्बोनेट, एनएएच 13सीओ3) केसाथ जीसी-एमएस के संयोजन का उपयोग दोनों नियंत्रण स्थितियों के तहत और बाहरी तनावों के जवाब में कोरल होलोबियोन्ट चयापचय नेटवर्क के माध्यम से प्रकाश संश्लेषक रूप से निश्चित कार्बन के भाग्य को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, 13 सी भाग्य की ट्रैकिंग में एक महत्वपूर्ण कदम कोरल कोशिकाओं से कोरल ऊतक का पृथक्करण है- केवल तभी कोरल होस्ट अंश में 13सी-लेबल यौगिक की उपस्थिति को स्पष्ट रूप से कोरल में स्थानांतरित सिम्बायोडिनियासी-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट या एक ट्रांसलोकेटेड लेबल यौगिक के डाउनस्ट्रीम उत्पाद के रूप में सौंपा जा सकता है। इस तकनीक ने लंबे समय से चली आ रही धारणा को चुनौती देकर अपनी शक्ति का प्रदर्शन किया है कि ग्लिसरॉल प्राथमिक रूप है जिसमें फोटोसिंथेट को सिम्बियोनेट से होस्ट29 में स्थानांतरित किया जाता है, साथ ही यह स्पष्ट किया जाता है कि ब्लीचिंग27,28 के दौरान और असंगत सिम्बियोडिनेसीप्रजातियों के जवाब में अंतर-साथी पोषण प्रवाह कैसे बदलता है।
जबकि ऊतकों को अलग करने का निर्णय मुख्य रूप से अनुसंधान प्रश्न से प्रेरित होता है, इस दृष्टिकोण की व्यावहारिकता, विश्वसनीयता और संभावित चयापचय प्रभावों पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यहां, हम होलोबियोन्ट से मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण के लिए विस्तृत, प्रदर्शित तरीके प्रदान करते हैं, साथ ही साथ अलग-अलग मेजबान और सिम्बियोनेट अंश भी प्रदान करते हैं। हम स्वतंत्र रूप से मेजबान और सिम्बियोनेट के मेटाबोलाइट प्रोफाइल की तुलना करते हैं और ये प्रोफाइल होलोबियोनेट मेटाबोलाइट प्रोफाइल की तुलना कैसे करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मेजबान और सिम्बियोनेट का पृथक्करण सरल सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से आसानी से और तेजी से प्राप्त किया जा सकता है, और यहां परिणाम बताते हैं कि अंशों को अलग करना विशिष्ट होलोबियोन्ट सदस्य योगदान के सं?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेएलएम को यूटीएस चांसलर रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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