كروماتوغرافيا الغاز - الأيض المستهدف القائم على قياس الطيف الكتلي لعينات المرجان الصلب
Summary
هنا ، نقدم استخراج وإعداد المستقلبات القطبية وشبه القطبية من holobiont المرجانية ، وكذلك الأنسجة المضيفة المرجانية المنفصلة وكسور خلايا Symbiodiniaceae ، لتحليل مطياف الكتلة اللوني الغازي.
Abstract
أثبتت الأساليب القائمة على قياس الطيف الكتلي اللوني للغاز (GC-MS) أنها قوية لتوضيح الأساس الأيضي لتكافل cnidarian-dinoflagellate وكيف يستجيب المرجان للإجهاد (أي أثناء التبييض الناجم عن درجة الحرارة). تم تطبيق التنميط المستقلب في الحالة المستقرة للهولوبيونت المرجاني ، والذي يضم المضيف cnidarian والميكروبات المرتبطة به (Symbiodiniaceae وغيرها من الطلائعيات والبكتيريا والعتائق والفطريات والفيروسات) بنجاح في ظل الظروف المحيطة والإجهاد لتوصيف الحالة الأيضية الشاملة للمرجان.
ومع ذلك ، للإجابة على الأسئلة المحيطة بالتفاعلات التكافلية ، من الضروري تحليل ملامح الأيض للمضيف المرجاني وتعايشاته الطحلبية بشكل مستقل ، والتي لا يمكن تحقيقها إلا عن طريق الفصل المادي وعزل الأنسجة ، يليها استخراج وتحليل مستقل. في حين أن تطبيق الأيض جديد نسبيا في مجال المرجان ، فقد أدت الجهود المستمرة لمجموعات البحث إلى تطوير طرق قوية لتحليل المستقلبات في الشعاب المرجانية ، بما في ذلك فصل الأنسجة المضيفة المرجانية والطحالب المتعايشة.
تقدم هذه الورقة دليلا تفصيليا لفصل holobiont واستخراج المستقلبات لتحليل GC-MS ، بما في ذلك خطوات التحسين الرئيسية للنظر فيها. نوضح كيف ، بمجرد تحليلها بشكل مستقل ، فإن ملف الأيض المشترك للجزأين (المرجان و Symbiodiniaceae) يشبه ملف تعريف الكل (holobiont) ، ولكن من خلال فصل الأنسجة ، يمكننا أيضا الحصول على معلومات أساسية حول التمثيل الغذائي والتفاعلات بين الشريكين التي لا يمكن الحصول عليها من الكل وحده.
Introduction
تمثل المستقلبات المنتجات النهائية للعمليات الخلوية ، ويمكن أن توفر الأيضات – دراسة مجموعة المستقلبات التي ينتجها كائن حي أو نظام بيئي معين – مقياسا مباشرا لعمل الكائن الحي1. وهذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لاستكشاف النظم الإيكولوجية والتفاعلات التكافلية وأدوات الاستعادة ، حيث أن الهدف من معظم استراتيجيات الإدارة هو الحفاظ على (أو استعادة) وظائف خدمة النظام الإيكولوجي المحددة2. الشعاب المرجانية هي أحد النظم الإيكولوجية المائية التي توضح القيمة المحتملة لعملية التمثيل الغذائي لتوضيح التفاعلات التكافلية وربط الاستجابات الفسيولوجية المرجانية بالتأثيرات على مستوى المجتمع ومستوى النظام الإيكولوجي3. يحظى تطبيق قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز عالي الإنتاجية (GC-MS) بتقدير خاص نظرا لقدرته على التحليل السريع لمجموعة واسعة من فئات الأيض في وقت واحد بانتقائية وحساسية عالية ، وتوفير تحديد سريع للمركب عند توفر المكتبات الطيفية ، وتوفير مستوى عال من التكرار والدقة ، بتكلفة منخفضة نسبيا لكل عينة.
الشعاب المرجانية هي holobionts تتكون من المرجان ، و endosymbionts dinoflagellate الضوئي (العائلة: Symbiodiniaceae4) ، وميكروبيوم معقد 5,6. بشكل عام ، يتم الحفاظ على لياقة holobiont في المقام الأول من خلال تبادل الجزيئات والعناصر الصغيرة لدعم الأداء الأيضي لكل عضو7،8،9،10. أثبتت الأساليب الأيضية أنها قوية بشكل خاص لتوضيح الأساس الأيضي لخصوصية التكافل 9,11 ، واستجابة التبييض للإجهاد الحراري7،8،12،13 ، واستجابات المرض 14 ، واستجابات التعرض للتلوث 15 ، والتأقلم الضوئي 16 ، والإشارات الكيميائية 17 في الشعاب المرجانية ، وكذلك المساعدة في اكتشاف العلامات الحيوية 18، 19. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر الأيضات تأكيدا قيما للاستنتاجات المستنتجة من التقنيات القائمة على الحمض النووي والحمض النووي الريبي9،20. لذلك ، هناك إمكانات كبيرة لاستخدام الأيض لتقييم صحة الشعاب المرجانية وتطوير أدوات للحفاظ على الشعاب المرجانية3 ، مثل من خلال الكشف عن المؤشرات الحيوية الأيضية للإجهاد18,19 ولدراسة إمكانات استراتيجيات الإدارة النشطة مثل الإعانات الغذائية21.
يمكن أن يؤدي فصل الخلايا المضيفة والخلايا المتعايشة وتحليل ملفات تعريف الأيض الخاصة بها بشكل مستقل ، بدلا من تجميعها معا مثل holobiont ، إلى مزيد من المعلومات حول تفاعلات الشريك ، والحالات الفسيولوجية والأيضية المستقلة ، والآليات الجزيئية المحتملة للتكيف11،12،22،23،24. بدون فصل المرجان و Symbiodiniaceae ، يكاد يكون من المستحيل توضيح مساهمة واستقلاب المرجان و / أو Symbiodiniaceae بشكل مستقل ، باستثناء إعادة بناء الجينوم المعقدة والنمذجة الأيضية25 ، ولكن هذا لم يتم تطبيقه بعد على تكافل المرجان ثنائي السوط. علاوة على ذلك ، فإن محاولة استخراج معلومات حول التمثيل الغذائي الفردي للمضيف أو الطحالب المتعايشة من ملف الأيض الخاص بالهولوبيونت يمكن أن يؤدي إلى سوء التفسير.
على سبيل المثال ، حتى وقت قريب ، كان يعتقد أن وجود الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة C18: 3n-6 و C18: 4n-3 و C16 في مستخلصات من أنسجة المرجان و holobiont مشتق من الطحالب المتكافلة ، حيث كان من المفترض أن الشعاب المرجانية لا تمتلك ωx desaturases الأساسية لإنتاج أحماض أوميغا 3 الدهنية (ω3) ؛ ومع ذلك ، تشير الأدلة الجينومية الحديثة إلى أن العديد من cnidarians لديهم القدرة على إنتاج ω3 PUFA de novo والمزيد من التخليق الحيوي ω3 PUFA26 طويل السلسلة. يمكن استخدام الجمع بين GC-MS مع وضع العلامات النظيرية المستقرة (على سبيل المثال ، 13 C-bicarbonate ، NaH13CO 3) لتتبع مصير الكربون الثابت ضوئيا من خلال شبكات التمثيل الغذائي holobiont المرجانية في ظل ظروف التحكم واستجابة للضغوط الخارجية27,28. ومع ذلك ، فإن الخطوة الحاسمة في تتبع مصير 13 C هي فصل الأنسجة المرجانية عن خلايا الطحالب – عندها فقط يمكن تعيين وجود مركب يحمل علامة 13C في جزء مضيف المرجان بشكل لا لبس فيه كمستقلب مشتق من Symbiodiniaceae يتم نقله إلى المرجان أو منتج مصب لمركب مسمى منقولة. أثبتت هذه التقنية قوتها من خلال تحدي الافتراض السائد منذ فترة طويلة بأن الجلسرين هو الشكل الأساسي الذي يتم فيه نقل التمثيل الضوئي من المتعايش إلى المضيف29 ، بالإضافة إلى توضيح كيفية تغير التدفق الغذائي بين الشركاء أثناء التبييض27,28 واستجابة لأنواع Symbiodiniaceae غير المتوافقة11.
في حين أن قرار فصل الأنسجة مدفوع في المقام الأول بسؤال البحث ، فإن التطبيق العملي والموثوقية والتأثيرات الأيضية المحتملة لهذا النهج مهمة في الاعتبار. هنا ، نقدم طرقا مفصلة ومثبتة لاستخراج المستقلبات من holobiont ، بالإضافة إلى الكسور المضيفة والمتعايشة المنفصلة. نقارن ملامح الأيض للمضيف والمتعايش بشكل مستقل وكيف تقارن هذه الملفات الشخصية بملف تعريف مستقلب holobiont.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تحقيق فصل المضيف والمتعايش بسهولة وسرعة عن طريق الطرد المركزي البسيط ، وتظهر النتائج هنا أن فصل الكسور يمكن أن يوفر معلومات قيمة تشير إلى مساهمات محددة لأعضاء holobiont ، والتي يمكن أن تسهم في التحليل الوظيفي لصحة المرجان. في الشعاب المرجانية البالغة ، يتم إجراء تخليق الدهون بشكل أس?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم JLM من قبل زمالة أبحاث مستشار UTS.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. , 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. , 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -. N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S., van Oppen, M., Lough, J. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. , 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
