Gaskromatografi-massespektrometri-baseret målrettet metabolomics af hårde koralprøver
Summary
Her præsenterer vi ekstraktion og fremstilling af polære og semipolære metabolitter fra en koralholobiont samt adskilt koralværtsvæv og Symbiodiniaceae-cellefraktioner til gaskromatografi-massespektrometrianalyse.
Abstract
Gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) -baserede tilgange har vist sig at være kraftfulde til at belyse det metaboliske grundlag for den cnidar-dinoflagellatsymbiose, og hvordan koraller reagerer på stress (dvs. under temperaturinduceret blegning). Steady-state metabolitprofilering af koralholobionten, som omfatter cnidarian værten og dens tilknyttede mikrober (Symbiodiniaceae og andre protister, bakterier, arkæer, svampe og vira), er blevet anvendt med succes under omgivende og stressforhold for at karakterisere korallens holistiske metaboliske status.
For at besvare spørgsmål omkring de symbiotiske interaktioner er det imidlertid nødvendigt at analysere koralværtsens metabolitprofiler og dets algesymbionter uafhængigt, hvilket kun kan opnås ved fysisk adskillelse og isolering af vævene efterfulgt af uafhængig ekstraktion og analyse. Mens anvendelsen af metabolomics er relativt ny på koralområdet, har forskergruppernes vedvarende indsats resulteret i udviklingen af robuste metoder til analyse af metabolitter i koraller, herunder adskillelse af koralværtsvæv og algesymbionter.
Dette papir præsenterer en trinvis vejledning til holobiont separation og ekstraktion af metabolitter til GC-MS-analyse, herunder vigtige optimeringstrin til overvejelse. Vi demonstrerer, hvordan den kombinerede metabolitprofil for de to fraktioner (koral og Symbiodiniaceae), når den analyseres uafhængigt, ligner helhedens profil (holobiont), men ved at adskille vævene kan vi også få nøgleinformation om metabolismen af og interaktionerne mellem de to partnere, der ikke kan opnås fra helheden alene.
Introduction
Metabolitter repræsenterer slutprodukterne af cellulære processer, og metabolomics – undersøgelsen af pakken af metabolitter produceret af en given organisme eller økosystem – kan give et direkte mål for organismens funktion1. Dette er især kritisk for at udforske økosystemer, symbiotiske interaktioner og genopretningsværktøjer, da målet med de fleste forvaltningsstrategier er at bevare (eller gendanne) specifikke økosystemtjenestefunktioner2. Koralrev er et akvatisk økosystem, der demonstrerer den potentielle værdi af metabolomics til belysning af symbiotiske interaktioner og sammenkobling af koralfysiologiske reaktioner på samfundsniveau og økosystemniveaupåvirkninger 3. Anvendelsen af gaskromatografi-massespektrometri med høj kapacitet (GC-MS) er især værdsat på grund af dets evne til hurtigt at analysere en bred vifte af metabolitklasser samtidigt med høj selektivitet og følsomhed, give hurtig forbindelsesidentifikation, når spektralbiblioteker er tilgængelige, og give et højt niveau af reproducerbarhed og nøjagtighed med relativt lave omkostninger pr. prøve.
Koraller er holobionter bestående af koraldyret, fotosyntetiske dinoflagellatendosymbionter (familie: Symbiodiniaceae4) og et komplekst mikrobiom 5,6. Samlet set opretholdes holobiontens egnethed primært gennem udveksling af små molekyler og elementer for at understøtte hvert medlems metaboliske funktion 7,8,9,10. Metabolomiske tilgange har vist sig særligt effektive til at belyse det metaboliske grundlag for symbiosespecificitet9,11, blegningsresponset på termisk stress 7,8,12,13, sygdomsrespons 14, forureningseksponeringsrespons 15, fotoakklimatisering 16 og kemisk signalering 17 i koraller samt hjælp til opdagelse af biomarkører 18,19. Derudover kan metabolomics give værdifuld bekræftelse af konklusionerne udledt af DNA- og RNA-baserede teknikker 9,20. Der er derfor et betydeligt potentiale for anvendelse af metabolomics til vurdering af revets sundhed og udvikling af værktøjer til bevarelse af rev3, f.eks. gennem påvisning af metaboliske biomarkører for stress18,19 og til undersøgelse af potentialet i aktive forvaltningsstrategier såsom ernæringstilskud21.
Adskillelse af værts- og symbiontcellerne og analyse af deres metabolitprofiler uafhængigt snarere end sammen som holobionten kan give mere information om partnerinteraktionerne, uafhængige fysiologiske og metaboliske statuser og potentielle molekylære mekanismer til tilpasning 11,12,22,23,24. Uden at adskille koraller og Symbiodiniaceae er det næsten umuligt at belyse bidraget og metabolismen af koraller og / eller Symbiodiniaceae uafhængigt, undtagen med kompleks genomrekonstruktion og metabolisk modellering25, men dette er endnu ikke anvendt på koral-dinoflagellatsymbiosen. Desuden kan forsøg på at udtrække information om den individuelle metabolisme af værts- eller algesymbionten fra holobiontens metabolitprofil føre til fejlfortolkning.
For eksempel blev tilstedeværelsen af C18: 3n-6, C18: 4n-3 og C16 flerumættede fedtsyrer i ekstrakter fra koraller og holobiontvæv indtil for nylig antaget at være afledt af algesymbiont, da koraller blev antaget ikke at have ωx desaturaser, der er essentielle for produktionen af omega-3 (ω3) fedtsyrer; nylige genomiske beviser tyder imidlertid på, at flere cnidarians har evnen til at producere ω3 PUFA de novo og yderligere biosyntetisere ω3 langkædet PUFA26. Kombination af GC-MS med stabil isotopmærkning (f.eks. 13 C-bicarbonat, NaH 13CO 3)kan bruges til at spore skæbnen for fotosyntetisk fikseret kulstof gennem koralholobiont metaboliske netværk under både kontrolbetingelser og som reaktion på eksterne stressorer27,28. Et kritisk skridt i sporingen af 13 C skæbne er imidlertid adskillelsen af koralvævet fra algecellerne – først da kan tilstedeværelsen af en 13C-mærket forbindelse i koralværtsfraktionen utvetydigt tildeles som en Symbiodiniaceae-afledt metabolit translokeret til korallen eller et nedstrøms produkt af en translokeret mærket forbindelse. Denne teknik har demonstreret sin magt ved at udfordre den langvarige antagelse om, at glycerol er den primære form, hvor fotosynthate translokeres fra symbiont til vært29, samt belyse, hvordan ernæringsflux mellem partnere ændres under blegning27,28 og som reaktion på uforenelige Symbiodiniaceae-arter11.
Mens beslutningen om at adskille væv primært er drevet af forskningsspørgsmålet, er det praktisk, pålidelighed og potentielle metaboliske virkninger af denne tilgang vigtigt at overveje. Her leverer vi detaljerede, demonstrerede metoder til ekstraktion af metabolitter fra holobionten såvel som de separate værts- og symbiontfraktioner. Vi sammenligner metabolitprofilerne for værten og symbionten uafhængigt, og hvordan disse profiler sammenligner med holobiontmetabolitprofilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adskillelsen af vært og symbiont kan let og hurtigt opnås via simpel centrifugering, og resultaterne her viser, at adskillelse af fraktionerne kan give værdifuld information, der indikerer specifikke holobionte medlemsbidrag, som kan bidrage til den funktionelle analyse af koralsundhed. I voksne koraller udføres lipidsyntese primært af den hjemmehørende algesymbiont40, som leverer lipider (f.eks. Triacylglycerol og phospholipider)41 og fedtsyrer, der kan fremme stressgenopretning <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. blev støttet af et UTS Chancellor’s Research Fellowship.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. , 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. , 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -. N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S., van Oppen, M., Lough, J. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. , 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
