Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters
Summary
Hier presenteren we de extractie en bereiding van polaire en semi-polaire metabolieten uit een koraalholobiont, evenals gescheiden koraalgastheerweefsel en Symbiodiniaceae celfracties, voor gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse.
Abstract
Op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) gebaseerde benaderingen hebben bewezen krachtig te zijn voor het ophelderen van de metabole basis van de symbiose tussen cnidarian en dinoflagellaat en hoe koraal reageert op stress (d.w.z. tijdens temperatuurgeïnduceerde bleking). Steady-state metabolietprofilering van het koraalholobiont, dat de cnidarian-gastheer en de bijbehorende microben (Symbiodiniaceae en andere protisten, bacteriën, archaea, schimmels en virussen) omvat, is met succes toegepast onder omgevings- en stressomstandigheden om de holistische metabole status van het koraal te karakteriseren.
Om vragen over de symbiotische interacties te beantwoorden, is het echter noodzakelijk om de metabolietprofielen van de koraalgastheer en zijn algensymbionten onafhankelijk te analyseren, wat alleen kan worden bereikt door fysieke scheiding en isolatie van de weefsels, gevolgd door onafhankelijke extractie en analyse. Hoewel de toepassing van metabolomics relatief nieuw is in het koraalveld, hebben de aanhoudende inspanningen van onderzoeksgroepen geresulteerd in de ontwikkeling van robuuste methoden voor het analyseren van metabolieten in koralen, inclusief de scheiding van het koraalgastheerweefsel en algensymbionten.
Dit artikel presenteert een stapsgewijze handleiding voor holobiont-scheiding en de extractie van metabolieten voor GC-MS-analyse, inclusief belangrijke optimalisatiestappen ter overweging. We laten zien hoe, eenmaal onafhankelijk geanalyseerd, het gecombineerde metabolietprofiel van de twee fracties (koraal en Symbiodiniaceae) vergelijkbaar is met het profiel van het geheel (holobiont), maar door de weefsels te scheiden, kunnen we ook belangrijke informatie verkrijgen over het metabolisme van en interacties tussen de twee partners die niet alleen uit het geheel kan worden verkregen.
Introduction
Metabolieten vertegenwoordigen de eindproducten van cellulaire processen, en metabolomics – de studie van de reeks metabolieten die door een bepaald organisme of ecosysteem worden geproduceerd – kan een directe maatstaf zijn voorhet functioneren van het organisme. Dit is met name van cruciaal belang voor het verkennen van ecosystemen, symbiotische interacties en herstelinstrumenten, aangezien het doel van de meeste beheerstrategieën is om specifieke ecosysteemdienstfuncties te behouden (of te herstellen)2. Koraalriffen zijn een aquatisch ecosysteem dat de potentiële waarde van metabolomics aantoont voor het ophelderen van symbiotische interacties en het koppelen van fysiologische reacties van koraal aan effecten op gemeenschaps- en ecosysteemniveau3. De toepassing van high-throughput gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) wordt vooral gewaardeerd vanwege het vermogen om snel een breed scala aan metabolietklassen gelijktijdig te analyseren met een hoge selectiviteit en gevoeligheid, een snelle identificatie van verbindingen te bieden wanneer spectrale bibliotheken beschikbaar zijn, en een hoge mate van reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid te bieden, met relatief lage kosten per monster.
Koralen zijn holobionten die bestaan uit het koraaldier, fotosynthetische dinoflagellaat-endosymbionten (familie: Symbiodiniaceae4) en een complex microbioom 5,6. Over het algemeen wordt de fitheid van de holobiont voornamelijk gehandhaafd door de uitwisseling van kleine moleculen en elementen om het metabolisch functioneren van elk lid te ondersteunen 7,8,9,10. Metabolomische benaderingen zijn bijzonder krachtig gebleken voor het ophelderen van de metabole basis van symbiosespecificiteit9,11, de bleekreactie op thermische stress 7,8,12,13, ziektereacties 14, blootstellingsreacties aan vervuiling 15, fotoacclimatisatie 16 en chemische signalering 17 bij koralen, evenals bij het helpen ontdekken van biomarkers 18,19. Bovendien kan metabolomics een waardevolle bevestiging bieden van de conclusies die worden afgeleid uit DNA- en RNA-gebaseerde technieken 9,20. Er is daarom een aanzienlijk potentieel voor het gebruik van metabolomics voor het beoordelen van de gezondheid van riffen en het ontwikkelen van instrumenten voor het behoud van riffen3, zoals door de detectie van metabole biomarkers van stress18,19 en voor het onderzoeken van het potentieel van actieve beheerstrategieën zoals voedingssubsidies21.
Het scheiden van de gastheer- en symbiontecellen en het onafhankelijk analyseren van hun metabolietprofielen, in plaats van samen als de holobiont, kan meer informatie opleveren over de partnerinteracties, onafhankelijke fysiologische en metabole statussen en mogelijke moleculaire mechanismen voor aanpassing 11,12,22,23,24. Zonder het koraal en de Symbiodiniaceae te scheiden, is het bijna onmogelijk om de bijdrage en het metabolisme van koraal en/of Symbiodiniaceae onafhankelijk van elkaar op te helderen, behalve met complexe genoomreconstructie en metabole modellering25, maar dit moet nog worden toegepast op de symbiose tussen koraal en dinoflagellaat. Bovendien kan een poging om informatie over het individuele metabolisme van de gastheer of algensymbiont uit het metabolietprofiel van de holobiont te halen, leiden tot verkeerde interpretatie.
Tot voor kort werd bijvoorbeeld gedacht dat de aanwezigheid van C18:3n-6, C18:4n-3 en C16 meervoudig onverzadigde vetzuren in extracten van koraal- en holobiontweefsels afkomstig was van de algensymbiont, omdat werd aangenomen dat koralen niet de ωx-desaturaten bezitten die essentieel zijn voor de productie van omega-3 (ω3) vetzuren; recent genoombewijs suggereert echter dat meerdere cnidarians het vermogen hebben om ω3 PUFA de novo te produceren en ω3 PUFA met lange keten verder te biosynthetiseren26. Het combineren van GC-MS met stabiele isotopenetikettering (bijv. 13 C-bicarbonaat, NaH 13CO3) kan worden gebruikt om het lot van fotosynthetisch gefixeerde koolstof te volgen via koraalholobiont-metabole netwerken onder zowel controleomstandigheden als als reactie op externe stressoren27,28. Een cruciale stap in het volgen van het lot van 13 C is echter de scheiding van het koraalweefsel van de algencellen – alleen dan kan de aanwezigheid van een 13C-gelabelde verbinding in de koraalgastheerfractie ondubbelzinnig worden toegewezen als een van Symbiodiniaceae afgeleide metaboliet die naar hetkoraal wordt verplaatst of een stroomafwaarts product van een getransloceerde gelabelde verbinding. Deze techniek heeft zijn kracht bewezen door de lang gekoesterde veronderstelling uit te dagen dat glycerol de primaire vorm is waarin fotosynthese wordt verplaatst van symbiont naar gastheer29, en door op te helderen hoe de voedingsflux tussen partners verandert tijdens het bleken27,28 en als reactie op incompatibele Symbiodiniaceae species11.
Hoewel de beslissing om weefsels te scheiden voornamelijk wordt gedreven door de onderzoeksvraag, zijn de bruikbaarheid, betrouwbaarheid en potentiële metabole effecten van deze aanpak belangrijk om te overwegen. Hier bieden we gedetailleerde, gedemonstreerde methoden voor de extractie van metabolieten uit de holobiont, evenals de afzonderlijke gastheer- en symbiontenfracties. We vergelijken de metabolietprofielen van de gastheer en symbiont onafhankelijk van elkaar en hoe deze profielen zich verhouden tot het holobiontmetabolietprofiel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De scheiding van de gastheer en de symbiont is gemakkelijk en snel haalbaar via eenvoudige centrifugatie, en de resultaten hier laten zien dat het scheiden van de fracties waardevolle informatie kan opleveren die wijst op specifieke bijdragen van holobiont-leden, die kunnen bijdragen aan de functionele analyse van de gezondheid van koraal. Bij volwassen koralen wordt de lipidensynthese voornamelijk uitgevoerd door de residente algensymbiont40, die lipiden levert (bijv. triacylglycerol en …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. werd ondersteund door een UTS Chancellor’s Research Fellowship.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. , 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. , 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -. N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S., van Oppen, M., Lough, J. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. , 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
