Métabolomique ciblée basée sur la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse d’échantillons de corail dur
Summary
Nous présentons ici l’extraction et la préparation de métabolites polaires et semi-polaires à partir d’un holobionte corallien, ainsi que de tissus coralliens hôtes séparés et de fractions cellulaires de Symbiodiniaceae, pour l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse.
Abstract
Les approches basées sur la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (GC-MS) se sont avérées puissantes pour élucider la base métabolique de la symbiose cnidaire-dinoflagellé et la façon dont le corail réagit au stress (c’est-à-dire pendant le blanchissement induit par la température). Le profilage des métabolites à l’état d’équilibre de l’holobionte corallien, qui comprend l’hôte cnidaire et ses microbes associés (Symbiodiniaceae et autres protistes, bactéries, archées, champignons et virus), a été appliqué avec succès dans des conditions ambiantes et de stress pour caractériser l’état métabolique holistique du corail.
Cependant, pour répondre aux questions entourant les interactions symbiotiques, il est nécessaire d’analyser les profils de métabolites de l’hôte corallien et de ses symbiotes algales indépendamment, ce qui ne peut être réalisé que par une séparation physique et un isolement des tissus, suivis d’une extraction et d’une analyse indépendantes. Bien que l’application de la métabolomique soit relativement nouvelle dans le domaine corallien, les efforts soutenus des groupes de recherche ont abouti au développement de méthodes robustes pour analyser les métabolites dans les coraux, y compris la séparation du tissu hôte du corail et des symbiotes d’algues.
Cet article présente un guide étape par étape pour la séparation des holobiontes et l’extraction des métabolites pour l’analyse GC-MS, y compris les étapes clés de l’optimisation à prendre en compte. Nous montrons comment, une fois analysé indépendamment, le profil métabolitique combiné des deux fractions (corail et Symbiodiniaceae) est similaire au profil de l’ensemble (holobionte), mais en séparant les tissus, nous pouvons également obtenir des informations clés sur le métabolisme et les interactions entre les deux partenaires qui ne peuvent être obtenues à partir de l’ensemble seul.
Introduction
Les métabolites représentent les produits finaux des processus cellulaires, et la métabolomique – l’étude de l’ensemble des métabolites produits par un organisme ou un écosystème donné – peut fournir une mesure directe du fonctionnement de l’organisme1. Ceci est particulièrement important pour l’exploration des écosystèmes, des interactions symbiotiques et des outils de restauration, car l’objectif de la plupart des stratégies de gestion est de préserver (ou de restaurer) des fonctions de services écosystémiques spécifiques2. Les récifs coralliens sont un écosystème aquatique qui démontre la valeur potentielle de la métabolomique pour élucider les interactions symbiotiques et relier les réponses physiologiques des coraux aux impacts au niveau de la communauté et de l’écosystème3. L’application de la chromatographie en phase gazeuse à haut débit et de la spectrométrie de masse (GC-MS) est particulièrement appréciée en raison de sa capacité à analyser rapidement un large éventail de classes de métabolites simultanément avec une sélectivité et une sensibilité élevées, à fournir une identification rapide des composés lorsque des bibliothèques spectrales sont disponibles et à fournir un haut niveau de reproductibilité et de précision, avec un coût par échantillon relativement faible.
Les coraux sont des holobiontes constitués de l’animal corallien, d’endosymbiontes photosynthétiques dinoflagellés (famille : Symbiodiniaceae4) et d’un microbiome complexe 5,6. Dans l’ensemble, l’aptitude de l’holobionte est maintenue principalement par l’échange de petites molécules et d’éléments pour soutenir le fonctionnement métabolique de chaque membre 7,8,9,10. Les approches métabolomiques se sont avérées particulièrement puissantes pour élucider les bases métaboliques de la spécificité de la symbiose9,11, de la réponse au blanchiment au stress thermique 7,8,12,13, des réponses aux maladies 14, des réponses à l’exposition à la pollution 15, de la photoacclimatation 16 et de la signalisation chimique 17 chez les coraux, ainsi que pour aider à la découverte de biomarqueurs 18,19. De plus, la métabolomique peut fournir une confirmation précieuse des conclusions déduites des techniques basées sur l’ADN et l’ARN 9,20. Il existe donc un potentiel considérable pour l’utilisation de la métabolomique pour évaluer la santé des récifs et développer des outils pour la conservation des récifs3, par exemple par la détection de biomarqueurs métaboliques du stress18,19 et pour examiner le potentiel de stratégies de gestion active telles que les subventions nutritionnelles21.
La séparation des cellules hôtes et symbiotes et l’analyse de leurs profils métabolites indépendamment, plutôt qu’ensemble comme l’holobionte, peuvent fournir plus d’informations sur les interactions des partenaires, les statuts physiologiques et métaboliques indépendants et les mécanismes moléculaires potentiels d’adaptation 11,12,22,23,24. Sans séparer le corail et les Symbiodiniaceae, il est presque impossible d’élucider la contribution et le métabolisme du corail et/ou des Symbiodiniaceae indépendamment, sauf avec la reconstruction complexe du génome et la modélisation métabolique25, mais cela n’a pas encore été appliqué à la symbiose corail-dinoflagellés. De plus, tenter d’extraire des informations sur le métabolisme individuel de l’hôte ou du symbiote algal à partir du profil métabolite de l’holobionte peut conduire à une mauvaise interprétation.
Par exemple, jusqu’à récemment, on pensait que la présence d’acides gras polyinsaturés C18 :3n-6, C18 :4n-3 et C16 dans des extraits de tissus de coraux et d’holobiontes était dérivée du symbiote algal, car on supposait que les coraux ne possédaient pas les ωx désaturases essentielles à la production d’acides gras oméga-3 (ω3) ; cependant, des preuves génomiques récentes suggèrent que plusieurs cnidaires ont la capacité de produire des AGPI ω3 de novo et de biosynthétiser davantage les AGPI26 à longue chaîne ω3. La combinaison de la GC-MS et du marquage isotopique stable (par exemple, 13 C-bicarbonate, NaH 13CO 3) peut être utilisée pour suivre le devenir du carbone fixé photosynthétiquement à travers les réseaux métaboliques holobiontes coralliens dans des conditions de contrôle et en réponse à des facteurs de stress externes27,28. Cependant, une étape critique dans le suivi du devenir du 13C est la séparation du tissu corallien des cellules algales – ce n’est qu’à ce moment-là que la présence d’un composé marqué au 13C dans la fraction de l’hôte corallien peut être attribuée sans équivoque comme un métabolite dérivé de Symbiodiniaceae transloqué au corail ou un produit en aval d’un composé marqué transloqué. Cette technique a démontré sa puissance en remettant en question l’hypothèse de longue date selon laquelle le glycérol est la principale forme dans laquelle la photosynthèse est transloquée du symbiote à l’hôte29, ainsi qu’en élucidant comment le flux nutritionnel inter-partenaires change pendant le blanchiment27,28 et en réponse à des espèces de Symbiodiniaceae incompatibles11.
Bien que la décision de séparer les tissus soit principalement motivée par la question de recherche, il est important de tenir compte de l’aspect pratique, de la fiabilité et des impacts métaboliques potentiels de cette approche. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées et démontrées pour l’extraction des métabolites de l’holobionte, ainsi que des fractions séparées de l’hôte et du symbiote. Nous comparons les profils de métabolites de l’hôte et du symbiote indépendamment et comment ces profils se comparent au profil de métabolite de l’holobionte.
Protocol
Representative Results
Discussion
La séparation de l’hôte et du symbiote est facilement et rapidement réalisable par simple centrifugation, et les résultats montrent ici que la séparation des fractions peut fournir des informations précieuses indiquant des contributions spécifiques des membres de l’holobionte, ce qui peut contribuer à l’analyse fonctionnelle de la santé des coraux. Chez les coraux adultes, la synthèse des lipides est principalement effectuée par le symbiote algalerésident 40, qui fournit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. a bénéficié d’une bourse de recherche du chancelier de l’UTS.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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