Gascromatografia-Metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro
Summary
Qui, presentiamo l’estrazione e la preparazione di metaboliti polari e semi-polari da un olobionte di corallo, nonché tessuto ospite di corallo separato e frazioni cellulari di Symbiodiniaceae, per l’analisi gascromatografica-spettrometria di massa.
Abstract
Gli approcci basati sulla gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) si sono dimostrati potenti per chiarire le basi metaboliche della simbiosi cnidario-dinoflagellata e il modo in cui il corallo risponde allo stress (ad esempio, durante lo sbiancamento indotto dalla temperatura). Il profilo dei metaboliti allo stato stazionario dell’olobionte del corallo, che comprende l’ospite cnidariano e i suoi microbi associati (Symbiodiniaceae e altri protisti, batteri, archaea, funghi e virus), è stato applicato con successo in condizioni ambientali e di stress per caratterizzare lo stato metabolico olistico del corallo.
Tuttavia, per rispondere alle domande che circondano le interazioni simbiotiche, è necessario analizzare i profili dei metaboliti dell’ospite corallo e dei suoi simbionti algali in modo indipendente, il che può essere ottenuto solo mediante separazione fisica e isolamento dei tessuti, seguita da estrazione e analisi indipendenti. Mentre l’applicazione della metabolomica è relativamente nuova nel campo dei coralli, gli sforzi sostenuti dei gruppi di ricerca hanno portato allo sviluppo di metodi robusti per l’analisi dei metaboliti nei coralli, compresa la separazione del tessuto ospite del corallo e dei simbionti algali.
Questo documento presenta una guida passo-passo per la separazione degli olobionti e l’estrazione dei metaboliti per l’analisi GC-MS, comprese le principali fasi di ottimizzazione da prendere in considerazione. Dimostriamo come, una volta analizzato in modo indipendente, il profilo metabolitico combinato delle due frazioni (corallo e Symbiodiniaceae) sia simile al profilo dell’insieme (olobionte), ma separando i tessuti, possiamo anche ottenere informazioni chiave sul metabolismo e sulle interazioni tra i due partner che non possono essere ottenute dal solo tutto.
Introduction
I metaboliti rappresentano i prodotti finali dei processi cellulari e la metabolomica – lo studio della serie di metaboliti prodotti da un determinato organismo o ecosistema – può fornire una misura direttadel funzionamento dell’organismo. Ciò è particolarmente importante per l’esplorazione degli ecosistemi, delle interazioni simbiotiche e degli strumenti di ripristino, poiché l’obiettivo della maggior parte delle strategie di gestione è quello di preservare (o ripristinare)specifiche funzioni dei servizi ecosistemici. Le barriere coralline sono un ecosistema acquatico che dimostra il valore potenziale della metabolomica per chiarire le interazioni simbiotiche e collegare le risposte fisiologiche dei coralli agli impatti a livello di comunità e di ecosistema3. L’applicazione della gascromatografia-spettrometria di massa ad alto rendimento (GC-MS) è particolarmente apprezzata per la sua capacità di analizzare rapidamente un’ampia gamma di classi di metaboliti contemporaneamente con elevata selettività e sensibilità, fornire una rapida identificazione dei composti quando sono disponibili librerie spettrali e fornire un elevato livello di riproducibilità e accuratezza, con un costo per campione relativamente basso.
I coralli sono olobionti costituiti dall’animale corallo, dagli endosimbionti dinoflagellati fotosintetici (famiglia: Symbiodiniaceae4) e da un microbioma complesso 5,6. Nel complesso, la fitness dell’olobionte viene mantenuta principalmente attraverso lo scambio di piccole molecole ed elementi per supportare il funzionamento metabolico di ciascun membro 7,8,9,10. Gli approcci metabolomici si sono dimostrati particolarmente efficaci per chiarire le basi metaboliche della specificità della simbiosi9,11, la risposta allo sbiancamento allo stress termico 7,8,12,13, le risposte alle malattie 14, le risposte all’esposizione all’inquinamento 15, la fotoacclimatazione16 e la segnalazione chimica 17 nei coralli, oltre a contribuire alla scoperta di biomarcatori 18,19. Inoltre, la metabolomica può fornire una preziosa conferma delle conclusioni dedotte dalle tecniche basate sul DNA e sull’RNA 9,20. Esiste, quindi, un notevole potenziale per l’uso della metabolomica per valutare la salute della barriera corallina e sviluppare strumenti per la conservazione della barriera corallina3, ad esempio attraverso l’individuazione di biomarcatori metabolici di stress18,19 e per esaminare il potenziale di strategie di gestione attiva come i sussidi nutrizionali21.
Separare le cellule ospite e simbionte e analizzare i loro profili metabolitici in modo indipendente, piuttosto che insieme come olobionte, può fornire maggiori informazioni sulle interazioni del partner, sugli stati fisiologici e metabolici indipendenti e sui potenziali meccanismi molecolari per l’adattamento 11,12,22,23,24. Senza separare il corallo dalle Symbiodiniaceae, è quasi impossibile chiarire il contributo e il metabolismo dei coralli e/o delle Symbiodiniaceae in modo indipendente, tranne che con la ricostruzione complessa del genoma e la modellazione metabolica25, ma questo deve ancora essere applicato alla simbiosi corallo-dinoflagellato. Inoltre, il tentativo di estrarre informazioni sul metabolismo individuale del simbionte ospite o algale dal profilo metabolitico dell’olobionte può portare a interpretazioni errate.
Ad esempio, fino a poco tempo fa, si pensava che la presenza di acidi grassi polinsaturi C18:3n-6, C18:4n-3 e C16 negli estratti di tessuti di corallo e olobionte derivasse dal simbionte algale, poiché si presumeva che i coralli non possedessero le desaturasi ωx essenziali per la produzione di acidi grassi omega-3 (ω3); tuttavia, recenti evidenze genomiche suggeriscono che più cnidari hanno la capacità di produrre ω3 PUFA de novo e di biosintetizzare ulteriormente ω3 PUFA26 a catena lunga. La combinazione di GC-MS con marcatura isotopica stabile (ad esempio, 13 C-bicarbonato, NaH13CO 3 ) può essere utilizzata per tracciare il destino del carbonio fissato fotosinteticamente attraverso le reti metaboliche degli olobionti corallini sia in condizioni di controllo che in risposta a fattori di stress esterni27,28. Tuttavia, un passo critico nel monitoraggio del destino del 13 C è la separazione del tessuto del corallo dalle cellule algali: solo allora la presenza di un composto marcato con 13C nella frazione ospite del corallo può essere inequivocabilmente assegnata come un metabolita derivato dalle Symbiodiniaceae traslocato nel corallo o un prodotto a valle di un composto marcato traslocato. Questa tecnica ha dimostrato la sua potenza sfidando l’ipotesi di lunga data che il glicerolo sia la forma primaria in cui il fotosintato, traslocato dal simbionte all’ospite29, oltre a chiarire come cambia il flusso nutrizionale tra i partner durante lo sbiancamento27,28 e in risposta a specie di Symbiodiniaceae incompatibili11.
Sebbene la decisione di separare i tessuti sia guidata principalmente dalla domanda di ricerca, la praticità, l’affidabilità e i potenziali impatti metabolici di questo approccio sono importanti da considerare. Qui, forniamo metodi dettagliati e dimostrati per l’estrazione dei metaboliti dall’olobionte, nonché dalle frazioni separate dell’ospite e del simbionte. Confrontiamo i profili dei metaboliti dell’ospite e del simbionte in modo indipendente e come questi profili si confrontano con il profilo del metabolita dell’olobionte.
Protocol
Representative Results
Discussion
La separazione dell’ospite e del simbionte è facilmente e rapidamente ottenibile tramite una semplice centrifugazione, e i risultati qui mostrano che la separazione delle frazioni può fornire preziose informazioni indicative di specifici contributi dei membri olobionti, che possono contribuire all’analisi funzionale della salute dei coralli. Nei coralli adulti, la sintesi lipidica è eseguita principalmente dal simbionte algale residente 40, che fornisce lipidi (ad esempio, triacilglicerolo e fosfolipidi)41 e …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. è stato sostenuto da una borsa di studio di ricerca del Cancelliere dell’UTS.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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