ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス
Summary
ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。
Abstract
ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)ベースのアプローチは、刺胞動物と渦鞭毛藻の共生の代謝基盤と、サンゴがストレス(つまり、温度による白化)にどのように応答するかを解明するのに強力であることが証明されています。刺胞動物の宿主とそれに関連する微生物(Symbiodiniaceaeと他の原生生物、細菌、古細菌、真菌、ウイルス)で構成されるサンゴのホロビオントの定常状態代謝物プロファイリングは、サンゴの全体的な代謝状態を特徴付けるために、環境条件およびストレス条件下でうまく適用されています。
しかし、共生相互作用をめぐる疑問に答えるためには、サンゴの宿主とその藻類共生生物の代謝物プロファイルを独立して解析する必要があり、これは組織の物理的な分離と単離、それに続く独立した抽出と分析によってのみ達成できます。メタボロミクスの応用はサンゴ分野では比較的新しいものですが、研究グループの継続的な努力により、サンゴの宿主組織と藻類共生生物の分離など、サンゴの代謝物を分析するための堅牢な方法が開発されました。
このホワイトペーパーでは、GC-MS 分析のためのホロビオント分離と代謝物の抽出について、検討すべき重要な最適化ステップを含め、ステップバイステップで説明します。2つの分画(サンゴとシンビオディニア科)の複合代謝物プロファイルが全体(ホロビオント)のプロファイルと類似していることを、独立して分析すると、組織を分離することで、全体だけでは得られない2つのパートナーの代謝と相互作用に関する重要な情報も得ることができることを実証します。
Introduction
代謝産物は細胞プロセスの最終生成物を表し、メタボロミクス(特定の生物または生態系によって生成される一連の代謝産物の研究)は、生物の機能の直接的な尺度を提供できます1。これは、ほとんどの管理戦略の目標は特定の生態系サービス機能を維持(または回復)することであるため、生態系、共生相互作用、および回復ツールを探求するために特に重要です2。サンゴ礁は、共生相互作用を解明し、サンゴの生理学的応答をコミュニティレベルおよび生態系レベルの影響に結びつけるためのメタボロミクスの潜在的な価値を実証する水生生態系の1つです3。ハイスループットガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)のアプリケーションは、幅広い代謝物クラスを高い選択性と感度で同時に迅速に分析し、スペクトルライブラリが利用可能な場合に迅速な化合物同定を提供し、サンプルあたりのコストが比較的低く、高レベルの再現性と精度を提供する能力があるため、特に高く評価されています。
サンゴは、サンゴ動物、光合成渦鞭毛藻類の内部共生生物(科:共生虫科4)、および複雑なマイクロバイオーム5,6からなるホロビオントです。全体として、ホロビオントの適応度は、主に各メンバーの代謝機能をサポートするための低分子および元素の交換によって維持される7,8,9,10。メタボロミクス的アプローチは、サンゴの共生特異性9,11、熱ストレスに対する白化応答7,8,12,13、疾患応答14、汚染曝露応答15、光順化16、化学シグナル伝達17の代謝基盤を解明し、バイオマーカーの発見18を支援するのに特に強力であることが証明されています、19。さらに、メタボロミクスは、DNAおよびRNAベースの技術から推測される結論の貴重な確認を提供することができます9,20。したがって、ストレスの代謝バイオマーカーの検出など、サンゴ礁の健康状態を評価し、サンゴ礁保全のためのツールを開発するためのメタボロミクスの使用にはかなりの可能性があります18,19栄養補助金21などの積極的な管理戦略の可能性を検討します。
宿主細胞と共生生物細胞を分離し、それらの代謝物プロファイルをホロビオントとして一緒に分析するのではなく、独立して分析することで、パートナーの相互作用、独立した生理学的および代謝状態、および適応のための潜在的な分子メカニズムについてより多くの情報を得ることができます11,12,22,23,24.サンゴと共生藻科を分離しなければ、複雑なゲノム再構成と代謝モデリングを除いて、サンゴおよび/または共生虫科の寄与と代謝を独立して解明することはほとんど不可能である25が、これはサンゴと渦鞭毛藻の共生にはまだ適用されていない。さらに、宿主や藻類の共生生物の個々の代謝に関する情報をホロビオントの代謝物プロファイルから抽出しようとすると、誤解を招く可能性があります。
例えば、サンゴやホロビオント組織からの抽出物中のC18:3n-6、C18:4n-3、およびC16多価不飽和脂肪酸の存在は、サンゴがオメガ3(ω3)脂肪酸の生産に不可欠なωx脱サチュラーゼを持っていないと考えられていたため、最近まで藻類共生生物に由来すると考えられていました。しかし、最近のゲノム証拠は、複数の刺胞動物がω3 PUFA de novoを産生し、さらにω3長鎖PUFAを生合成する能力を持っていることを示唆しています26。GC-MSと安定同位体標識(例:13 C-重炭酸塩、NaH 13CO 3)を組み合わせることで、制御条件下および外部ストレス要因への応答の両方で、サンゴのホロビオント代謝ネットワークを介して光合成的に固定された炭素の運命を追跡することができます27,28。しかし、13Cの運命を追跡する上で重要なステップは、藻類細胞からのサンゴ組織の分離であり、サンゴの宿主画分に13C標識化合物が存在する場合にのみ、サンゴに転座したシンビオディニア科由来の代謝物または転座した標識化合物の下流生成物として明確に割り当てることができます。この技術は、光合成が共生生物から宿主へと移動する主要な形態はグリセロールであるという長年の仮定に異議を唱え29、白化中にパートナー間の栄養フラックスがどのように変化するかを解明することによってその力を実証しました27,28および互換性のないSymbiodiniaceae種11。
組織を分離する決定は、主に研究課題によって左右されますが、このアプローチの実用性、信頼性、および潜在的な代謝への影響を考慮することが重要です。ここでは、ホロビオントから代謝物を抽出するための詳細で実証された方法、および宿主と共生生物の分画を分離します。宿主と共生生物の代謝物プロファイルを独立して比較し、これらのプロファイルをホロビオントの代謝物プロファイルとどのように比較するか。
Protocol
Representative Results
Discussion
宿主と共生生物の分離は、簡単な遠心分離によって簡単かつ迅速に達成でき、ここでの結果は、フラクションを分離することで、特定のホロビオントメンバーの寄与を示す貴重な情報が得られ、サンゴの健康の機能分析に貢献できることを示しています。成体のサンゴでは、脂質合成は主に常在する藻類共生生物40によって行われ、脂質(例えば、トリアシルグリセロ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M.は、UTS Chancellor’s Research Fellowshipの支援を受けました。
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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