Газовая хромато-масс-спектрометрия на основе таргетной метаболомики образцов твердых кораллов
Summary
Здесь мы представляем экстракцию и подготовку полярных и полуполярных метаболитов из голобионта коралла, а также разделенной ткани хозяина коралла и клеточных фракций Symbiodiniaceae для анализа газовой хромато-масс-спектрометрии.
Abstract
Подходы, основанные на газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС), оказались эффективными для выяснения метаболической основы симбиоза книдарии и динофлагеллятов и того, как кораллы реагируют на стресс (например, во время температурно-индуцированного обесцвечивания). Стационарное профилирование метаболитов кораллового голобионта, который включает в себя книдарийного хозяина и связанные с ним микробы (Symbiodiniaceae и другие протисты, бактерии, археи, грибы и вирусы), было успешно применено в условиях окружающей среды и стресса для характеристики целостного метаболического статуса коралла.
Однако, чтобы ответить на вопросы, связанные с симбиотическими взаимодействиями, необходимо проанализировать профили метаболитов коралла-хозяина и его водорослевых симбионтов независимо друг от друга, что может быть достигнуто только путем физического разделения и изоляции тканей с последующим независимым извлечением и анализом. Несмотря на то, что применение метаболомики является относительно новым для коралловой области, постоянные усилия исследовательских групп привели к разработке надежных методов анализа метаболитов в кораллах, включая разделение тканей коралла-хозяина и симбионтов водорослей.
В данной работе представлено пошаговое руководство по разделению голобионтов и экстракции метаболитов для анализа ГХ-МС, включая основные шаги оптимизации для рассмотрения. Мы демонстрируем, что при независимом анализе комбинированный профиль метаболитов двух фракций (коралловые и Symbiodiniaceae) похож на профиль целого (голобионт), но, разделяя ткани, мы также можем получить ключевую информацию о метаболизме и взаимодействиях между двумя партнерами, которая не может быть получена только из целого.
Introduction
Метаболиты представляют собой конечные продукты клеточных процессов, а метаболомика – изучение набора метаболитов, продуцируемых данным организмом или экосистемой – может обеспечить прямую меруфункционирования организма. Это особенно важно для изучения экосистем, симбиотических взаимодействий и инструментов восстановления, поскольку целью большинства стратегий управления является сохранение (или восстановление) конкретных функций экосистемныхуслуг2. Коралловые рифы представляют собой одну из водных экосистем, которая демонстрирует потенциальную ценность метаболомики для выяснения симбиотических взаимодействий и увязки физиологических реакций кораллов с воздействием на уровне общин и экосистем3. Применение высокопроизводительной газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) особенно ценится из-за ее способности быстро анализировать широкий спектр классов метаболитов одновременно с высокой селективностью и чувствительностью, обеспечивать быструю идентификацию соединений при наличии спектральных библиотек и обеспечивать высокий уровень воспроизводимости и точности при относительно низкой стоимости образца.
Кораллы являются голобионтами, состоящими из кораллового животного, фотосинтезирующих динофлагеллятных эндосимбионтов (семейство: Symbiodiniaceae4) и сложного микробиома 5,6. В целом, приспособленность голобионта поддерживается в основном за счет обмена малыми молекулами и элементами для поддержки метаболического функционирования каждого члена 7,8,9,10. Метаболомные подходы оказались особенно эффективными для выяснения метаболических основ специфичности симбиоза9,11, реакции обесцвечивания на термический стресс 7,8,12,13, реакции на болезнь 14, реакции на воздействие загрязнения 15, фотоакклиматизации16 и химической сигнализации 17 у кораллов, а также помощи в обнаружении биомаркеров 18С. 19. Кроме того, метаболомика может дать ценное подтверждение выводов, сделанных на основе методов на основе ДНК и РНК 9,20. Таким образом, существует значительный потенциал для использования метаболомики для оценки состояния рифов и разработки инструментов для ихсохранения3, например, путем выявления метаболических биомаркеров стресса18,19 и для изучения потенциала стратегий активного управления, таких как субсидии на питание21.
Разделение клеток хозяина и симбионта и анализ их метаболитных профилей независимо друг от друга, а не вместе, как голобионт, может дать больше информации о взаимодействиях партнеров, независимых физиологических и метаболических статусах, а также потенциальных молекулярных механизмах адаптации 11,12,22,23,24. Без разделения кораллов и Symbiodiniaceae практически невозможно пролить свет на вклад и метаболизм кораллов и/или Symbiodiniaceae независимо друг от друга, за исключением сложной реконструкции генома и метаболического моделирования25, но это еще предстоит применить к симбиозу кораллов и динофлагеллятов. Кроме того, попытка извлечь информацию об индивидуальном метаболизме хозяина или водорослевого симбионта из метаболитного профиля голобионта может привести к неправильной интерпретации.
Например, до недавнего времени считалось, что присутствие полиненасыщенных жирных кислот C18:3n-6, C18:4n-3 и C16 в экстрактах тканей кораллов и голобионтов происходит от водорослей-симбионтов, поскольку считалось, что кораллы не обладают ωx-десатуразами, необходимыми для производства омега-3 (ω3) жирных кислот; однако недавние геномные данные свидетельствуют о том, что многие книдарии обладают способностью продуцировать ω3 ПНЖК de novo и далее биосинтезировать ω3 длинноцепочечный ПНЖК26. Сочетание ГХ-МС со стабильным изотопным мечением (например, 13 С-бикарбонат, 13CO 3) может быть использовано для отслеживания судьбы фотосинтетически фиксированного углерода через метаболические сети голобионтов кораллов как в контрольных условиях, так и в ответ на внешние стрессоры27,28. Тем не менее, критическим этапом в отслеживании судьбы 13С является отделение ткани коралла от клеток водорослей – только в этом случае присутствие меченого 13С соединения во фракции хозяина коралла может быть однозначно отнесено к метаболиту, полученному из Symbiodiniaceae, транслоцированному в коралл, или как последующий продукт транслоцированного меченого соединения. Этот метод продемонстрировал свою силу, бросив вызов давнему предположению о том, что глицерин является основной формой, в которой фотосинтезат перемещается от симбионта к хозяину29, а также прояснив, как изменяется поток питательных веществ между партнерами во время обесцвечивания27,28 и в ответ на несовместимые виды Symbiodiniaceae11.
В то время как решение о разделении тканей в первую очередь обусловлено исследовательским вопросом, важно учитывать практичность, надежность и потенциальное метаболическое воздействие этого подхода. Здесь мы приводим подробные, продемонстрированные методы извлечения метаболитов из голобионта, а также отдельных фракций хозяина и симбионта. Мы сравниваем профили метаболитов хозяина и симбионта независимо друг от друга и сравниваем эти профили с профилем метаболита голобионта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разделение хозяина и симбионта легко и быстро достигается с помощью простого центрифугирования, и результаты показывают, что разделение фракций может предоставить ценную информацию, указывающую на специфический вклад голобионтов, что может способствовать функциональному анали…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. был поддержан исследовательской стипендией UTS Chancellor’s Research Fellowship.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. , 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. , 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -. N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S., van Oppen, M., Lough, J. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. , 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
