Her præsenterer vi en affinitetsrensningsmetode af et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus , der er enkelt, billigt og effektivt.
Det fibrinolytiske enzym fra Sipunculus nudus (sFE) er et nyt fibrinolytisk middel, der både kan aktivere plasminogen i plasmin og nedbryde fibrin direkte, hvilket viser store fordele i forhold til traditionelle trombolytiske midler. På grund af manglen på strukturel information er alle rensningsprogrammer for sFE imidlertid baseret på flertrinskromatografirensninger, som er for komplicerede og dyre. Her udvikles en affinitetsrensningsprotokol for sFE for første gang baseret på en krystalstruktur af sFE; det omfatter fremstilling af råprøven og lysin/arginin-agarosematrix-affinitetskromatografikolonnen, affinitetsoprensning og karakterisering af den rensede sFE. Efter denne protokol kan et parti sFE renses inden for 1 dag. Desuden øges renheden og aktiviteten af den rensede sFE til henholdsvis 92% og 19.200 E / ml. Dette er således en enkel, billig og effektiv tilgang til sFE-rensning. Udviklingen af denne protokol er af stor betydning for den videre anvendelse af sFE og andre lignende midler.
Trombose er en stor trussel mod folkesundheden, især efter den globale covid-19-pandemi 1,2. Klinisk er mange plasminogenaktivatorer (PA’er), såsom vævstype plasminogenaktivator (tPA) og urokinase (UK), blevet anvendt i vid udstrækning som trombolytiske lægemidler. PA’er kan aktivere patienternes plasminogen til aktivt plasmin for at nedbryde fibrin. Således er deres trombolytiske effektivitet stærkt begrænset af patienternes plasminogenstatus 3,4. Fibrinolytiske midler, såsom metalloproteinaseplasmin og serinplasmin, er en anden type klinisk trombolytisk lægemiddel, der også inkluderer fibrinolytiske enzymer (FE), såsom plasmin, som kan opløse blodpropper direkte, men hurtigt inaktiveres af forskellige plasminhæmmere5. Efterfølgende er der rapporteret om en ny type fibrinolytisk middel, der kan opløse tromben ved ikke kun at aktivere plasminogenet i plasmin, men også nedbryde fibrinet direkte 6-det fibrinolytiske enzym fra den gamle jordnøddeorm Sipunculus nudus (sFE)6. Denne bifunktion giver sFE andre fordele i forhold til traditionelle trombolytiske lægemidler, især med hensyn til unormal plasminogenstatus. Sammenlignet med andre bifunktionelle fibrinolytiske midler 7,8,9 viser sFE flere fordele, herunder sikkerhed, i forhold til ikke-fødevareafledte midler til lægemiddeludvikling, især for orale lægemidler. Dette skyldes, at biosikkerheden og biokompatibiliteten af Sipunculus nudus er veletableret10.
I lighed med de andre naturlige fibrinolytiske midler isoleret fra mikroorganismer, regnorme og svampe er oprensningen af sFE fra S. nudus meget kompliceret og inkluderer flere trin, såsom vævshomogenisering, ammoniumsulfatudfældning, afsaltning, anionbytterkromatografi, hydrofob interaktionskromatografi og molekylær sigtning10,11,12. Et sådant rensningssystem afhænger ikke kun af dygtige færdigheder og dyre materialer, men kræver også flere dage for at fuldføre hele proceduren. Derfor er et simpelt rensningsprogram af sFE af stor betydning for den videre udvikling af sFE. Heldigvis to krystaller af sFE (PDB: 8HZP; FBF: 8HZO) er opnået med succes (se supplerende fil 1 og supplerende fil 2). Gennem strukturel analyse og molekylære dockingeksperimenter fandt vi, at den katalytiske kerne i sFE specifikt kunne binde til mål, der indeholder arginin eller lysinrester.
Heri blev et affinitetsrensningssystem foreslået for første gang baseret på krystalstrukturen af sFE. Ved at følge denne protokol kunne meget ren og meget aktiv sFE renses fra de rå ekstrakter i et enkelt affinitetsrensningstrin. Den protokol, der udvikles her, er ikke kun vigtig for den store fremstilling af sFE, men kan også anvendes til oprensning af andre fibrinolytiske midler.
På grund af utilgængeligheden af den nøjagtige gensekvens af sFE blev den aktuelt anvendte sFE ekstraheret fra frisk S. nudus14. Desuden var rensningsprocedurerne for sFE rapporteret i litteraturen komplicerede og dyre, da de var baseret på nogle generelle træk ved sFE, såsom molekylvægt, isoelektrisk punkt, ionstyrke og polaritet15,16. Ingen affinitetsrensningsprotokol for sFE er blevet rapporteret til dato. I denne unders…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) og Science and Technology Bureau of Fujian-provinsen (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
Agarose G-10 | Biowest | ||
Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
Fibrinogen | Merck | ||
Glycine | Solarbio | ||
Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
Kinase | RHAWN | ||
Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
Sodium chloride | SINOPHARM | ||
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
Thrombin | Meilunbio | ||
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
Equipment | |||
AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
Microwave Oven | Galanz | ||
Milli-Q Reference | Millipore | ||
Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
Consumable Material | |||
200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
Parafilm | Bemis | ||
Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
Universal pH Indicator | SSS Reagent |