Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus

Resumo

Aqui, apresentamos um método de purificação por afinidade de uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que é simples, barato e eficiente.

Resumo

A enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) é um novo agente fibrinolítico que pode tanto ativar o plasminogênio em plasmina quanto degradar a fibrina diretamente, apresentando grandes vantagens sobre os trombolíticos tradicionais. No entanto, devido à falta de informações estruturais, todos os programas de purificação para sFE são baseados em purificações por cromatografia em várias etapas, que são muito complicadas e caras. Aqui, um protocolo de purificação por afinidade de sFE é desenvolvido pela primeira vez baseado em uma estrutura cristalina de sFE; inclui a preparação da amostra bruta e da coluna de cromatografia de afinidade da matriz lisina/arginina-agarose, purificação por afinidade e caracterização do FE purificado. Seguindo este protocolo, um lote de sFE pode ser purificado dentro de 1 dia. Além disso, a pureza e a atividade do FE purificado aumentam para 92% e 19.200 U/mL, respectivamente. Assim, esta é uma abordagem simples, barata e eficiente para purificação de sFE. O desenvolvimento deste protocolo é de grande importância para a posterior utilização de sFE e outros agentes similares.

Introdução

A trombose é uma grande ameaça à saúde pública, especialmente após a pandemia global de Covid-19 ^1,2. Clinicamente, muitos ativadores do plasminogênio (APs), como o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e a uroquinase (UK), têm sido amplamente utilizados como trombolíticos. Os APs podem ativar o plasminogênio dos pacientes em plasmina ativa para degradar a fibrina. Assim, sua eficácia trombolítica é fortemente limitada pelo estado plasminogênico dos pacientes ^3,4. Os agentes fibrinolíticos, como a plasmina metaloproteinase e a serina plasmina, são o....

Protocolo

1. Preparo

1. Tratamento da amostra
   1. Dissecar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) e coletar o intestino e seu líquido interno.
   2. Adicionar 300 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneização (1.000 rpm, 60 s).
   3. Congelar-descongelar o homogeneizado 3x.
   4. Centrifugar a amostra (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) e recolher o sobrenadante. Conservar a amostra a 4 °C até nova utilização.
2. Precipitação proteica
   1. Misture o sobrenadante com uma solução saturada de sulfato de amónio (nove volumes) e deixe repousar durante 12 h a 4 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausad....

Resultados

Seguindo este protocolo, lisados teciduais brutos foram extraídos, colunas de cromatografia de afinidade com matriz de arginina-agarose e matriz de lisina-agarose foram construídas, FE purificado foi obtido e a pureza e atividade fibrinolítica do FE purificado foram medidas por SDS-PAGE e placas de fibrina, respectivamente.

Após a centrifugação, o sobrenadante coletado foi um líquido viscoso bronzeado transparente. A precipitação iniciou-se quando este sobrenadante foi misturado com solução sa.......

Discussão

Devido à indisponibilidade da sequência exata do gene sFE, o FE atualmente utilizado foi extraído de S. nudus fresco ¹⁴. Além disso, os procedimentos de purificação da FEs relatados na literatura foram complicados e dispendiosos, pois se basearam em algumas características gerais da FEs, como peso molecular, ponto isoelétrico, força iônica e polaridade^15,16. Nenhum protocolo de purificação de afinidade de FEs foi relatado até o mo.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
30% Acrilamida-Bisacrilamida (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoetanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Persulfato de amônio	SINOPHARM
4B	Solarbio	Matriz de arginina-agarose
Bromoxilenol Azul (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogênio	Merck
Glicina	Solarbio
Ácido clorídrico	SINOPHARM
Quinase	RHAWN
Lisina-Sepharose 4B	Matriz Solarbio	Lisina-agarose
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Sigma-Aldrich
(10-170 kD)	Beyotime
	SINOPHARM
Dodecil Sulfonato de Sódio (SDS)	Hidróxido de
	SINOPHARM
Trombina	Meilunbio
Tris (Hidroximetil) Aminometano	Solarbio
Tris (Hidroximetil) Cloridrato de Aminometano	Solarbio
Equipment
AKT Sistema de Purificação de Aprotein	GE
Esterilizador a vapor de pressão vertical automática MLS-3750	Sistema de
Bomba de fluxo constante GE
Incubadora de temperatura constante	JINGHONG
Centrífuga refrigerada de mesa 3-30KS	SIGMA
DGG-9140AD	SENXIN
Homogeneizador de vidro elétrico DY89-II	SCIENTZ
Balança analítica eletrônica	DENVER
Banho-maria eletrotermostático DK-S12	SENXIN
Agitador de descoloração horizontal	Kylin-Bell
Máquina de gelo AF 103	Scotsman
KQ-500E Limpador Ultrassônico	Agitador Magnético Zhi
	wei
Micro Centrífuga Refrigerada H1650-W	Forno
	Galanz
Milli-Q Referência	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Medidor de pH de Mesa de Precisão	Sartorious
Oscilador de Vórtice de Tamanho Pequeno	Vertical Kylin-Bell
	Bio-Rad
Material Consumível
200 µ L Tubo de PCR (200 µ L)	Axygene
(1,5 mL)	Biosharp
(5 mL)	Biosharp
(50 mL)
(7 mL)	Biosharp
(60 mm)
(0,22 µ m)	Millex GP
Parafilm	Bemis
(1 mL)	KIRGEN
(10 µ L)	Ponta de Pipeta Axygene
(200 µ L)	Axygene
Filtro Ultra Centrífugo TZAKZY
(4 mL 3 KDa)	Reagente

Sulfato de amônio SINOPHARM Arginina-Sepharose Marcador de Proteína de Cor Prestained Cloreto de sódio sódio Sigma-Aldrich puro imagem de quimioluminescência SANYO BT-100 QITE DHG Series Forno de aquecimento e secagem de Microondas Cence Sistema de Eletroforese Tubo de Centrífuga Tubo de Centrífuga Tubo de Centrífuga Tubo de Centrífuga NEST Placa de Cultura Membrana de Filtro NEST Ponta de Pipeta Ponta de Pipeta Papel Indicador Especial Unidade de (15 mL 3 KDa)Unidade de Filtro Ultra Centrífuga Millipore SSS Indicador Universal de pH Millipore