"सिपुन्कुलस न्यूडस से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम का आत्मीयता शुद्धिकरण"।
Summary
यहां, हम सिपुन्कुलस न्यूडस से एक फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम की एक आत्मीयता शोधन विधि प्रस्तुत करते हैं जो सरल, सस्ती और कुशल है।
Abstract
सिपुन्कुलस न्यूडस (एसएफई) से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम एक नया फाइब्रिनोलिटिक एजेंट है जो प्लास्मिनोजेन को प्लास्मिन में सक्रिय कर सकता है और सीधे फाइब्रिन को नीचा दिखा सकता है, पारंपरिक थ्रोम्बोलाइटिक एजेंटों पर बहुत फायदे दिखा सकता है। हालांकि, संरचनात्मक जानकारी की कमी के कारण, एसएफई के लिए सभी शुद्धिकरण कार्यक्रम मल्टीस्टेप क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण पर आधारित हैं, जो बहुत जटिल और महंगे हैं। यहां, एसएफई की क्रिस्टल संरचना के आधार पर पहली बार एसएफई का एक आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल विकसित किया गया है; इसमें कच्चे नमूने की तैयारी और लाइसिन / आर्जिनिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम, आत्मीयता शुद्धि और शुद्ध एसएफई के लक्षण वर्णन शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एसएफई के एक बैच को 1 दिन के भीतर शुद्ध किया जा सकता है। इसके अलावा, शुद्ध एसएफई की शुद्धता और गतिविधि क्रमशः 92% और 19,200 यू / एमएल तक बढ़ जाती है। इस प्रकार, यह एसएफई शुद्धिकरण के लिए एक सरल, सस्ती और कुशल दृष्टिकोण है। एसएफई और अन्य समान एजेंटों के आगे उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल का विकास बहुत महत्वपूर्ण है।
Introduction
थ्रोम्बोसिस सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा है, खासकर कोविड -19 वैश्विक महामारी 1,2 के बाद। नैदानिक रूप से, कई प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर्स (पीए), जैसे ऊतक-प्रकार प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर (टीपीए) और यूरोकाइनेज (यूके), का व्यापक रूप से थ्रोम्बोलाइटिक दवाओं के रूप में उपयोग किया जाता है। पीए फाइब्रिन को नीचा दिखाने के लिए रोगियों के प्लास्मिनोजेन को सक्रिय प्लास्मिन में सक्रिय कर सकते हैं। इस प्रकार, उनकी थ्रोम्बोलाइटिक दक्षता रोगियों की प्लास्मिनोजेन स्थिति 3,4 द्वारा भारी प्रतिबंधित है। फाइब्रिनोलिटिक एजेंट, जैसे कि मेटालोप्रोटीनेज प्लास्मिन और सेरीन प्लास्मिन, एक अन्य प्रकार की नैदानिक थ्रोम्बोलाइटिक दवा है जिसमें प्लास्मिन जैसे फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम (एफई) भी शामिल हैं, जो सीधे थक्के को भंग कर सकते हैं लेकिन विभिन्न प्लास्मिनअवरोधकों द्वारा जल्दी से निष्क्रिय हो जाते हैं। इसके बाद, एक नए प्रकार के फाइब्रिनोलिटिक एजेंट की सूचना दी गई है जो न केवल प्लास्मिनोजेन को प्लास्मिन में सक्रिय करके थ्रोम्बस को भंग कर सकता है, बल्कि फाइब्रिन को सीधे 6-प्राचीन मूंगफली के कीड़े सिपुन्कुलस न्यूडस (एसएफई) 6 से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम को भी कम कर सकता है। यह द्विफलन एसएफई को पारंपरिक थ्रोम्बोलाइटिक दवाओं पर अन्य फायदे प्रदान करता है, खासकर असामान्य प्लास्मिनोजेन स्थिति के संदर्भ में। अन्य द्विक्रियाशील फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों 7,8,9 की तुलना में, एसएफई दवा के विकास के लिए गैर-खाद्य व्युत्पन्न एजेंटों पर सुरक्षा सहित कई फायदे प्रदर्शित करता है, खासकर मौखिक दवाओं के लिए। ऐसा इसलिए है क्योंकि सिपुन्कुलस न्यूडस की जैव सुरक्षा और जैव-रासायनिकता अच्छी तरहसे स्थापित की गई है।
सूक्ष्मजीवों, केंचुओं और मशरूम से अलग अन्य प्राकृतिक फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों के समान, एस नुडस से एसएफई का शुद्धिकरण बहुत जटिल है और इसमें कई चरण शामिल हैं, जैसे ऊतक समरूपीकरण, अमोनियम सल्फेट वर्षा, विलवणीकरण, आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी, और आणविक चोरी10,11,12।. इस तरह की शुद्धि प्रणाली न केवल कुशल कौशल और महंगी सामग्री पर निर्भर करती है, बल्कि पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए कई दिनों की भी आवश्यकता होती है। इसलिए, एसएफई के आगे के विकास के लिए एसएफई का एक सरल शुद्धिकरण कार्यक्रम बहुत महत्वपूर्ण है। सौभाग्य से, एसएफई के दो क्रिस्टल (पीडीबी: 8एचजेडपी; PDB: 8HZO) सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया है (पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 देखें)। संरचनात्मक विश्लेषण और आणविक डॉकिंग प्रयोगों के माध्यम से, हमने पाया कि एसएफई का उत्प्रेरक कोर विशेष रूप से आर्गिनिन या लाइसिन अवशेषों वाले लक्ष्यों से जुड़ सकता है।
इसमें, एसएफई की क्रिस्टल संरचना के आधार पर पहली बार एक आत्मीयता शुद्धिकरण प्रणाली प्रस्तावित की गई थी। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, अत्यधिक शुद्ध और अत्यधिक सक्रिय एसएफई को एक ही आत्मीयता शुद्धिकरण चरण में कच्चे अर्क से शुद्ध किया जा सकता है। यहां विकसित प्रोटोकॉल न केवल एसएफई की बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि अन्य फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों के शुद्धिकरण के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसएफई के सटीक जीन अनुक्रम की अनुपलब्धता के कारण, वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले एसएफई को ताजा एस नुडस14 से निकाला गया था। इसके अलावा, साहित्य में रिपोर्ट की गई एसएफई की शुद्धिकरण प्रक्रिया?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को ज़ियामेन सिटी के विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (3502Z20227197) और फ़ुज़ियान प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (संख्या 2019J01070, No.2021Y0027) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
Referências
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
