Purificazione per affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus
Summary
Qui, presentiamo un metodo di purificazione di affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus che è semplice, economico ed efficiente.
Abstract
L’enzima fibrinolitico di Sipunculus nudus (sFE) è un nuovo agente fibrinolitico che può sia attivare il plasminogeno in plasmina che degradare direttamente la fibrina, mostrando grandi vantaggi rispetto agli agenti trombolitici tradizionali. Tuttavia, a causa della mancanza di informazioni strutturali, tutti i programmi di purificazione per sFE si basano su purificazioni cromatografiche multifase, che sono troppo complicate e costose. Qui, un protocollo di purificazione di affinità di sFE viene sviluppato per la prima volta basato su una struttura cristallina di sFE; comprende la preparazione del campione grezzo e della colonna cromatografica di affinità della matrice lisina/arginina-agarosio, la purificazione dell’affinità e la caratterizzazione della sFE purificata. Seguendo questo protocollo, un lotto di sFE può essere purificato entro 1 giorno. Inoltre, la purezza e l’attività della sFE purificata aumentano rispettivamente al 92% e a 19.200 U/ml. Pertanto, questo è un approccio semplice, economico ed efficiente per la purificazione sFE. Lo sviluppo di questo protocollo è di grande importanza per l’ulteriore utilizzo di sFE e altri agenti simili.
Introduction
La trombosi è una grave minaccia per la salute pubblica, soprattutto a seguito della pandemia globale di Covid-19 1,2. Clinicamente, molti attivatori del plasminogeno (PA), come l’attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) e l’urochinasi (Regno Unito), sono stati ampiamente utilizzati come farmaci trombolitici. Le PA possono attivare il plasminogeno dei pazienti in plasmina attiva per degradare la fibrina. Pertanto, la loro efficienza trombolitica è fortemente limitata dallo stato del plasminogeno dei pazienti 3,4. Gli agenti fibrinolitici, come la plasmina metalloproteinasi e la plasmina serina, sono un altro tipo di farmaco trombolitico clinico che include anche enzimi fibrinolitici (FE) come la plasmina, che possono sciogliere direttamente i coaguli ma sono rapidamente inattivati da vari inibitori della plasmina5. Successivamente, è stato riportato un nuovo tipo di agente fibrinolitico che può dissolvere il trombo non solo attivando il plasminogeno in plasmina, ma anche degradando direttamente la fibrina 6-l’enzima fibrinolitico dall’antico verme delle arachidi Sipunculus nudus (sFE)6. Questa bifunzione conferisce a sFE altri vantaggi rispetto ai farmaci trombolitici tradizionali, specialmente in termini di stato anomalo del plasminogeno. Rispetto ad altri agenti fibrinolitici bifunzionali 7,8,9, sFE mostra diversi vantaggi, tra cui la sicurezza, rispetto agli agenti derivati non alimentari per lo sviluppo di farmaci, in particolare per i farmaci orali. Questo perché la biosicurezza e la biocompatibilità di Sipunculus nudus sono state ben stabilite10.
Analogamente agli altri agenti fibrinolitici naturali isolati da microrganismi, lombrichi e funghi, la purificazione di sFE da S. nudus è molto complicata e comprende più fasi, come l’omogeneizzazione dei tessuti, la precipitazione del solfato di ammonio, la desalinizzazione, la cromatografia a scambio anionico, la cromatografia di interazione idrofobica e la setacciatura molecolare10,11,12. Un tale sistema di purificazione non dipende solo da competenze competenti e materiali costosi, ma richiede anche diversi giorni per completare l’intera procedura. Pertanto, un semplice programma di purificazione di sFE è di grande importanza per l’ulteriore sviluppo di sFE. Fortunatamente, due cristalli di sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) sono stati ottenuti con successo (vedere File supplementare 1 e File supplementare 2). Attraverso analisi strutturali ed esperimenti di docking molecolare, abbiamo scoperto che il nucleo catalitico di sFE potrebbe legarsi specificamente a bersagli contenenti residui di arginina o lisina.
Qui, è stato proposto per la prima volta un sistema di purificazione di affinità, basato sulla struttura cristallina di sFE. Seguendo questo protocollo, la sFE altamente pura e altamente attiva potrebbe essere purificata dagli estratti grezzi in un unico stadio di purificazione di affinità. Il protocollo sviluppato qui non è importante solo per la preparazione su larga scala di sFE, ma può anche essere applicato per la purificazione di altri agenti fibrinolitici.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa dell’indisponibilità dell’esatta sequenza genica di sFE, la sFE attualmente utilizzata è stata estratta da S. nudus14 fresco. Inoltre, le procedure di purificazione di sFE riportate in letteratura erano complicate e costose, in quanto basate su alcune caratteristiche generali di sFE, come il peso molecolare, il punto isoelettrico, la forza ionica e la polarità15,16. Nessun protocollo di purificazione di affinità di sFE…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dall’Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (3502Z20227197) e dall’Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070, n. 2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
Referências
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