Affinitetsrening av ett fibrinolytiskt enzym från Sipunculus nudus
Summary
Här presenterar vi en affinitetsreningsmetod för ett fibrinolytiskt enzym från Sipunculus nudus som är enkel, billig och effektiv.
Abstract
Det fibrinolytiska enzymet från Sipunculus nudus (sFE) är ett nytt fibrinolytiskt medel som både kan aktivera plasminogen till plasmin och bryta ner fibrin direkt, vilket visar stora fördelar jämfört med traditionella trombolytiska medel. På grund av bristen på strukturell information är emellertid alla reningsprogram för sFE baserade på flerstegskromatografireningar, som är för komplicerade och kostsamma. Här utvecklas för första gången ett affinitetsreningsprotokoll för sFE baserat på en kristallstruktur av sFE; Det innefattar beredning av råprovet och kolonnen för lysin/arginin-agarosmatrisaffinitetskromatografi, affinitetsrening och karakterisering av renat sFE. Efter detta protokoll kan en sats sFE renas inom 1 dag. Dessutom ökar renheten och aktiviteten hos den renade sFE till 92% respektive 19 200 U / ml. Således är detta ett enkelt, billigt och effektivt tillvägagångssätt för sFE-rening. Utvecklingen av detta protokoll är av stor betydelse för vidare utnyttjande av sFE och andra liknande medel.
Introduction
Trombos är ett stort hot mot folkhälsan, särskilt efter den globala pandeminCovid-19 1,2. Kliniskt har många plasminogenaktivatorer (PA), såsom plasminogenaktivator av vävnadstyp (tPA) och urokinas (UK), använts i stor utsträckning som trombolytiska läkemedel. PA kan aktivera patientens plasminogen till aktivt plasmin för att bryta ned fibrin. Således är deras trombolytiska effektivitet starkt begränsad av patientens plasminogenstatus 3,4. Fibrinolytiska medel, såsom metalloproteinasplasmin och serinplasmin, är en annan typ av kliniskt trombolytiskt läkemedel som också innehåller fibrinolytiska enzymer (FE) såsom plasmin, som kan lösa blodproppar direkt men snabbt inaktiveras av olika plasminhämmare5. Därefter har en ny typ av fibrinolytiskt medel rapporterats som kan lösa tromben genom att inte bara aktivera plasminogen i plasmin utan också bryta ner fibrinet direkt 6-det fibrinolytiska enzymet från den gamla jordnötsmasken Sipunculus nudus (sFE)6. Denna bifunktion ger sFE andra fördelar jämfört med traditionella trombolytiska läkemedel, särskilt när det gäller onormal plasminogenstatus. Jämfört med andra bifunktionella fibrinolytiska medel 7,8,9 visar sFE flera fördelar, inklusive säkerhet, jämfört med icke-livsmedelshärledda medel för läkemedelsutveckling, särskilt för orala läkemedel. Detta beror på att biosäkerheten och biokompatibiliteten hos Sipunculus nudus har varit väletablerad10.
I likhet med de andra naturliga fibrinolytiska medlen isolerade från mikroorganismer, daggmaskar och svampar är reningen av sFE från S. nudus mycket komplicerad och innefattar flera steg, såsom vävnadshomogenisering, ammoniumsulfatutfällning, avsaltning, anjonbyteskromatografi, hydrofob interaktionskromatografi och molekylsiktning10,11,12. Ett sådant reningssystem beror inte bara på skickliga färdigheter och dyra material, men kräver också flera dagar för att slutföra hela proceduren. Därför är ett enkelt reningsprogram av sFE av stor betydelse för den fortsatta utvecklingen av sFE. Lyckligtvis två kristaller av sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) har erhållits framgångsrikt (se kompletterande fil 1 och kompletterande fil 2). Genom strukturanalys och molekylära dockningsexperiment fann vi att den katalytiska kärnan i sFE specifikt kunde binda till mål som innehåller arginin- eller lysinrester.
Häri föreslogs för första gången ett affinitetsreningssystem, baserat på kristallstrukturen hos sFE. Genom att följa detta protokoll kan mycket ren och högaktiv sFE renas från råextrakten i ett enda affinitetsreningssteg. Protokollet som utvecklats här är inte bara viktigt för storskalig beredning av sFE, utan kan också tillämpas för rening av andra fibrinolytiska medel.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av otillgängligheten av den exakta gensekvensen av sFE extraherades den för närvarande använda sFE från färsk S. nudus14. Dessutom var reningsförfarandena för sFE som rapporterats i litteraturen komplicerade och kostsamma, eftersom de baserades på vissa allmänna egenskaper hos sFE, såsom molekylvikt, isoelektrisk punkt, jonstyrka och polaritet15,16. Inget affinitetsreningsprotokoll för sFE har hittills rappor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) och Science and Technology Bureau of Fujian Province (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
Referências
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
