O presente protocolo descreve uma estratégia abrangente para avaliar a ação farmacológica e o mecanismo do salidrosídeo na inibição da proliferação e migração de células MCF-7.
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Artigo de método
Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7
Neste artigo
Resumo
Resumo
Salidrosídeo (Sal) contém atividades farmacológicas anticarcinogênicas, anti-hipóxicas e anti-inflamatórias. No entanto, seus mecanismos subjacentes contra o câncer de mama foram apenas incompletamente elucidados. Assim, este protocolo pretendeu decodificar o potencial do Sal na regulação da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 na proliferação maligna de células MCF-7 de câncer de mama humano. Primeiramente, a atividade farmacológica do Sal contra MCF-7 foi avaliada por CCK-8 e ensaios de arranhão celular. Além disso, a resistência das células MCF-7 foi medida por ensaios de migração e invasão de Matrigel. Para ensaios de apoptose celular e ciclo, as células MCF-7 foram processadas em etapas com anexina V-FITC/PI e kits de detecção de ciclo celular para análises por citometria de fluxo, respectivamente. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e Ca2+ foram examinados pelas colorações de imunofluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM. As atividades da Na+-K+-ATPase e da Ca2+-ATPase foram determinadas utilizando os kits comerciais correspondentes. Os níveis de expressão gênica e proteica na apoptose e na via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 foram posteriormente determinados usando análises de western blot e qRT-PCR, respectivamente. Descobrimos que o tratamento com Sal restringiu significativamente a proliferação, migração e invasão de células MCF-7 com efeitos dose-dependentes. Enquanto isso, a administração do Sal também forçou dramaticamente as células MCF-7 a sofrer apoptose e parada do ciclo celular. Os testes de imunofluorescência mostraram que o Sal estimulou observavelmente a produção de ROS e Ca2+ em células MCF-7. Dados adicionais confirmaram que Sal promoveu os níveis de expressão de proteínas pró-apoptóticas, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivada e seus genes correspondentes. Consistentemente, a intervenção com Sal reduziu proeminentemente a expressão das proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e seus genes correspondentes. Em conclusão, o Sal pode ser usado como um potencial composto derivado de ervas para o tratamento do câncer de mama, pois pode reduzir a proliferação, migração e invasão malignas de células MCF-7 inibindo a via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introdução
Como um dos cânceres mais comumente diagnosticados e malignidades mais comuns, as estatísticas mais recentes indicam que 2,3 milhões de casos de câncer de mama surgiram em todo o mundo até 2020, representando 11,7% de todos os casos de câncer1. Os sintomas comuns do câncer de mama incluem sensibilidade mamária e formigamento, nódulos e dor mamária, secreção mamilar, erosão ou pele afundada e linfonodos axilares aumentados 1,2. Ainda mais alarmante, o número de novos casos e a incidência geral de câncer de mama continuam a aumentar a uma taxa avassaladora a cada ano, sendo responsáveis p....
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Protocolo
As células MCF-7 utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Cultura celular
- Cultivar as células MCF-7 em atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C com DMEM contendo FBS a 10% e penicilina a 1% (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As células que cobrem 90% do fundo da placa foram empregadas para o experimento e divididas nos seguintes grupos: grupo controle, grupo cloridrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) e grupo Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM), ou grupo controle, grupo LY294002 (10 μM....
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Resultados
Efeitos do Sal na inibição do excesso de proliferação e retardo da cicatrização de feridas em células MCF-7
Para sondar o potencial do Sal contra o câncer de mama, primeiro testamos suas propriedades anticancerígenas usando ensaios de toxicidade de proliferação celular e arranhões da linhagem celular MCF-7 do câncer de mama humano. Essas células foram co-incubadas com uma série de concentração de Sal (5-320 μM) por 24 h, e a proliferação celular foi avaliada usando um ensaio CCK-8. Observou-se efeito .......
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Discussão
O câncer de mama acomete indivíduos de todas as idades e causa incalculável sobrecarga física e mental e grande pressão econômica1. O câncer de mama, com sua crescente morbidade e mortalidade a cada ano, também tem atraído a atenção mundial na busca de terapias compostas fitoterápicas eficazes além dos tratamentos convencionais 4,5. De forma promissora, um grande corpo de evidências tem revelado os efeitos anticancerígenos do Sal
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Comissão de Saúde da Província de Sichuan (120025).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1% de penicilina/estreptomicina | HyClone | SV30010 | |
| anticorpo AKT | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Anexina V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Leitor automático de microplacas | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax anticorpo | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| Kit BCA | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 anticorpo | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Células de Anticorpo Bim | , Inc. | #2933 | |
| Ca2+– Kit de ensaio ATPase | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Kit de contagem de células-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Kit de coloração do ciclo celular | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| caspase-3 clivada | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| caspase-7 clivada | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| caspase-9 clivada | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Solução violeta de cristal | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM meio de cultura de alta glicose | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Cloridrato de doxorrubicina | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL solução quimioluminescente | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Soro bovino fetal | Procell Life Science & Fornecedor:Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Citômetro de fluxo | BD | FACSCanto  | |
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 anticorpo | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Versão 6.0 | |
| HIF-1α anticorpo | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Linha celular de câncer de mama humano MCF-7 | Procell Life Science & Fornecedor:Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Buffer de carregamento | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel Thermo | |||
| anticorpo mTOR | Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| Na+– K+– Kit de ensaio ATPase | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Microscópio óptico | Olympus | IX71PH | |
| anticorpo p-AKT | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K anticorpo | Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| anticorpo p-PI3K | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Sistema quantitativo de imagem de western blot | Touch Image Pro | eBlot | |
| Transcrição reversa kit de síntese de cDNA de primeira fita | Servicebio Technology Co., Ltd. | ROS G3330-100 | |
| está incluída aqui | |||
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Kit de isolamento de RNA total | Foregene | RE-03014 | |
| Tripsina | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actina | Affinity Biosciences | AF7018 |
Referências
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al.
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Reimpressões e permissões
