Utforske den farmakologiske virkningen og molekylære mekanismen til salidrosid ved å hemme MCF-7-celleproliferasjon og migrasjon

Summary

Denne protokollen beskriver en omfattende strategi for evaluering av salidrosids farmakologiske virkning og mekanisme for å hemme MCF-7-celleproliferasjon og migrasjon.

Abstract

Salidroside (Sal) inneholder anti-kreftfremkallende, anti-hypoksiske og antiinflammatoriske farmakologiske aktiviteter. Imidlertid har de underliggende anti-brystkreftmekanismene bare blitt ufullstendig belyst. Derfor hadde denne protokollen til hensikt å dekode potensialet til Sal for å regulere PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen i den ondartede spredningen av humant brystkreft MCF-7-celler. For det første ble den farmakologiske aktiviteten til Sal mot MCF-7 evaluert ved CCK-8 og celleskrapeanalyser. Videre ble motstanden til MCF-7-celler målt ved migrasjon og Matrigel invasjonsanalyser. For celleapoptose og syklusanalyser ble MCF-7-celler behandlet i trinn med henholdsvis vedlegg V-FITC / PI og cellesyklusfargedeteksjonssett for flowcytometrianalyser. Nivåene av reaktive oksygenarter (ROS) og Ca²⁺ ble undersøkt ved DCFH-DA og Fluo-4 AM immunfluorescensfarging. Aktivitetene til Na+-K⁺-ATPase og Ca²⁺-ATPase ble bestemt ved bruk av tilsvarende kommersielle sett. Protein- og genuttrykksnivåene i apoptose og PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-banen ble videre bestemt ved hjelp av henholdsvis western blot- og qRT-PCR-analyser. Vi fant at Sal-behandling signifikant begrenset spredning, migrasjon og invasjon av MCF-7-celler med doseavhengige effekter. I mellomtiden tvang Sal-administrasjonen også dramatisk MCF-7-celler til å gjennomgå apoptose og cellesyklusarrest. Immunfluorescenstestene viste at Sal observerbart stimulerte ROS og Ca²⁺ produksjon i MCF-7-celler. Ytterligere data bekreftet at Sal fremmet ekspresjonsnivåene av pro-apoptotiske proteiner, Bax, Bim, spaltet caspase-9/7/3, og deres tilsvarende gener. Konsekvent reduserte Sal-intervensjon tydelig uttrykket av Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α og FoxO1-proteiner og deres tilsvarende gener. Avslutningsvis kan Sal brukes som en potensiell urt-avledet forbindelse for behandling av brystkreft, da det kan redusere ondartet spredning, migrasjon og invasjon av MCF-7-celler ved å hemme PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen.

Introduction

Som en av de vanligste kreftene og vanligste malignitetene, indikerer den siste statistikken at 2,3 millioner tilfeller av brystkreft dukket opp rundt om i verden innen 2020, og utgjorde 11,7% av alle krefttilfeller¹. Vanlige symptomer på brystkreft inkluderer ømme og prikkende bryster, brystklumper og smerter, utslipp fra brystvorter, erosjon eller nedsunket hud og forstørrede aksillære lymfeknuter ^1,2. Enda mer alarmerende, antall nye tilfeller og den totale forekomsten av brystkreft fortsetter å øke med en overveldende hastighet hvert år, og står for 6.9% av kreftrelaterte dødsfall¹. For tiden involverer brystkreftintervensjon fortsatt hovedsakelig kjemoterapi, kirurgi, strålebehandling og omfattende behandling. Selv om behandling effektivt kan redusere tilbakefallsraten og dødeligheten hos pasienter, forårsaker langvarig behandlingsapplikasjon ofte multiresistens, stort hårtap, kvalme og oppkast og alvorlig psykisk og psykologisk belastning ^2,3. Spesielt tvinger den potensielle risikoen for flere organmetastaser fra brystkreft også folk til å søke nye urtekilder til medisinering ^4,5.

Fosfoinositid 3 kinase (PI3K)-mediert signalering er involvert i vekst, spredning og overlevelse av brystkreft gjennom spleising som påvirker uttrykket av flere gener⁶. Som et nedstrøms signalfølende protein av PI3K, tyder mange bevis på at proteinkinase B (AKT) kan koble seg sammen med pattedyrmålet for rapamycin (mTOR) protein for ytterligere å øke brystkreft ^7,8,9. Videre har deaktivering av PI3K/AKT/mTOR-signalering også blitt hevdet å være en nøkkelkomponent i legemidler som hemmer ondartet spredning og stimulerer apoptose ved brystkreft^10,11,12. Det er velkjent at ekstrem hypoksi i tumormikromiljøet tvinger en massiv økning i hypoksi-induserbar faktor 1 alfa (HIF-1α), noe som ytterligere forverrer utviklingen av brystkreft^13,14,15. Parallelt fører AKT-stimulering også til overdreven akkumulering av HIF-1α, noe som begrenser apoptose i brystkreftprøver^16,17. Interessant nok har aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering blitt bekreftet å være involvert i patologisk progresjon og metastase i en rekke kreftformer, inkludert lungekreft¹⁸, kolorektal kreft¹⁹, eggstokkreft²⁰ og prostatakreft²¹. I tillegg til å være orkestrert av HIF-1α, utløses også overekspresjon av gaffelhodetranskripsjonsfaktor 1 (FoxO1) av AKT-signalstimulering, som fremmer syklusstans og hemming av apoptose i brystkreftceller^22,23. Sammen antyder de ovennevnte solide bevisene at inhiberingen av kaskaden av PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signalering kan være et potensielt nytt mål for medisinering i brystkreft.

Salidroside (Sal) har vist seg å utøve anti-kreft 24,25, anti-hypoksi^26,27,28,29, og immunforsterkende farmakologiske aktiviteter³⁰. Det er et lysebrunt eller brunt pulver som er lett løselig i vann, er en type fenyletanoid glykosid, og har en kjemisk strukturformel på C₁₄H₂₀O₇ og en molekylvekt på 300, 3^{31, 32}. Moderne farmakologiske undersøkelser har vist at Sal kan fremme apoptose av magekreftceller ved å begrense PI3K-AKT-mTOR-signalering²⁴. Ytterligere bevis tyder også på at undertrykkelse av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering ved Sal-behandling kan bidra til apoptose av kreftceller ved å øke følsomheten for kjemoterapeutiske midler²⁵. Bevis tyder også på at Sal begrenser cellemigrasjon og invasjon og forårsaker syklusarrest ved å fremme apoptose i den humane brystkreften MCF-7-celler^33,34. Det gjenstår imidlertid å se om Sal kan regulere PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signalering og hemme den ondartede proliferasjonen av MCF-7-celler. Derfor hadde denne protokollen som mål å utforske effekten av Sal på MCF-7-cellemigrasjon, invasjon, cellesyklus og apoptose via PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen. De integrerte forskningsstrategiene som omfatter konvensjonelle, rimelige og uavhengige eksperimenter, for eksempel cellemigrasjon og invasjonsvurderinger, apoptose og cellesyklusdeteksjon ved flowcytometri, reaktive oksygenarter (ROS) og Ca²⁺ fluorescensbestemmelse, etc., kan gi en referanse for den overordnede utformingen av eksperimenter for anti-kreftforskning med tradisjonell urtemedisin. Den eksperimentelle prosessen i denne studien er vist i figur 1.

Protocol

MCF-7-cellene som ble brukt i denne studien ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialfortegnelsen). 1. Cellekultur Dyrkning av MCF-7-cellene i en fuktet 5 %CO2-atmosfære ved 37 °C med DMEM inneholdende 10 % FBS og 1 % penicillin (10 000 U/ml)/streptomycin (10 000 μg/ml) (se materialfortegnelsen).MERK: Cellene som dekker 90% av bunnen av parabolen ble ansatt for eksperimentet og tildelt følgende grupper: kont…

Representative Results

Effekter av Sal på å hemme overflødig spredning og forsinke sårheling i MCF-7-cellerFor å undersøke potensialet til Sal mot brystkreft, testet vi først dets kreftegenskaper ved hjelp av celleproliferasjonstoksisitet og ripeanalyser av den humane brystkreften MCF-7-cellelinjen. Disse cellene ble co-inkubert med en konsentrasjonsserie av Sal (5-320 μM) i 24 timer, og celleproliferasjonen ble evaluert ved hjelp av en CCK-8-analyse. En doseavhengig hemmende effekt av Sal på celleproliferasjon bl…

Discussion

Brystkreft rammer personer i alle aldre og forårsaker uberegnelig fysisk og psykisk belastning og stort økonomisk press¹. Brystkreft, med sin økende sykelighet og dødelighet hvert år, har også tiltrukket seg verdensomspennende oppmerksomhet når det gjelder å søke effektive urtebaserte sammensatte terapier utover konvensjonelle behandlinger ^4,5. Lovende har en stor mengde bevis avslørt anti-kreft effekter av Sal^2…

Materials

1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018