JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Exploración de la acción farmacológica y el mecanismo molecular del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65634
, , , , , , ,
1Pathology Department,Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery,the Third People’s Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

El presente protocolo describe una estrategia integral para evaluar la acción farmacológica y el mecanismo del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7.

Abstract

El salidrósido (Sal) contiene actividades farmacológicas anticancerígenas, antihipóxicas y antiinflamatorias. Sin embargo, sus mecanismos subyacentes contra el cáncer de mama solo se han dilucidado de manera incompleta. Por lo tanto, este protocolo pretendía decodificar el potencial de Sal en la regulación de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 en la proliferación maligna de células MCF-7 de cáncer de mama humano. En primer lugar, se evaluó la actividad farmacológica de la Sal frente a MCF-7 mediante ensayos de CCK-8 y scratch celular. Además, la resistencia de las células MCF-7 se midió mediante ensayos de migración e invasión de Matrigel. Para los ensayos de apoptosis y ciclo celular, las células MCF-7 se procesaron en pasos con anexina V-FITC/PI y kits de detección de tinción de ciclo celular para análisis de citometría de flujo, respectivamente. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y Ca2+ se examinaron mediante tinción de inmunofluorescencia DCFH-DA y Fluo-4 AM. Las actividades de Na+-K+-ATPasa y Ca2+-ATPasa se determinaron utilizando los kits comerciales correspondientes. Los niveles de expresión de proteínas y genes en la apoptosis y la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 se determinaron mediante análisis de Western blot y qRT-PCR, respectivamente. Encontramos que el tratamiento con Sal restringió significativamente la proliferación, migración e invasión de las células MCF-7 con efectos dependientes de la dosis. Mientras tanto, la administración de Sal también obligó drásticamente a las células MCF-7 a sufrir apoptosis y detención del ciclo celular. Las pruebas de inmunofluorescencia mostraron que Sal estimuló de forma observable la producción de ROS y Ca2+ en las células MCF-7. Otros datos confirmaron que Sal promovió los niveles de expresión de las proteínas proapoptóticas, Bax, Bim, caspasa-9/7/3 escindida y sus genes correspondientes. Consistentemente, la intervención de Sal redujo de manera prominente la expresión de las proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α y FoxO1 y sus genes correspondientes. En conclusión, la sal se puede utilizar como un compuesto potencial derivado de hierbas para tratar el cáncer de mama, ya que puede reducir la proliferación, migración e invasión maligna de las células MCF-7 al inhibir la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

Como uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y las neoplasias malignas más comunes, las últimas estadísticas indican que en 2020 surgieron 2,3 millones de casos de cáncer de mama en todo el mundo, lo que representa el 11,7% de todos los casos de cáncer1. Los síntomas comunes del cáncer de mama incluyen sensibilidad y hormigueo en los senos, bultos y dolor en los senos, secreción del pezón, erosión o piel hundida y agrandamiento de los ganglios linfáticos axilares 1,2. Y lo que es aún más alarmante, el número de nuevos casos y la incidencia general del cáncer de mama siguen aumentando a un ritmo abrumador cada año, y representan el 6,9% de las muertes relacionadas con el cáncer1. En la actualidad, la intervención del cáncer de mama sigue siendo principalmente quimioterapia, cirugía, radioterapia y tratamiento integral. A pesar de que el tratamiento puede reducir eficazmente la tasa de recurrencia y la tasa de mortalidad de los pacientes, la aplicación del tratamiento a largo plazo a menudo causa la aparición de multirresistencia, pérdida de cabello en grandes áreas, náuseas y vómitos, y una grave carga mental y psicológica 2,3. En particular, el riesgo potencial de metástasis de múltiples órganos por cáncer de mama también obliga a las personas a buscar nuevas fuentes herbales de terapia farmacológica 4,5.

La señalización mediada por la fosfoinositida 3 quinasa (PI3K) está implicada en el crecimiento, la proliferación y la supervivencia del cáncer de mama a través del empalme que afecta a la expresión de múltiples genes6. Como proteína de detección de señales aguas abajo de PI3K, numerosas evidencias sugieren que la proteína quinasa B (AKT) podría acoplarse con la proteína diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) para aumentar aún más el cáncer de mama 7,8,9. Además, también se ha afirmado que la desactivación de la señalización de PI3K/AKT/mTOR es un componente clave en los fármacos que inhiben la proliferación maligna y estimulan la apoptosis en el cáncer de mama10,11,12. Es bien sabido que la hipoxia extrema en el microambiente tumoral obliga a un aumento masivo del factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α), lo que empeora aún más la progresión del cáncer de mama13,14,15. Paralelamente, la estimulación de AKT también conduce a una acumulación excesiva de HIF-1α, limitando la apoptosis en muestras de cáncer de mama16,17. Curiosamente, se ha confirmado que la activación de la señalización PI3K-AKT-HIF-1α está involucrada en la progresión patológica y la metástasis en una variedad de cánceres, incluidos el cáncer de pulmón18, el cáncer colorrectal19, el cáncer de ovario20 y el cáncer de próstata21. Además de ser orquestada por HIF-1α, la sobreexpresión del factor de transcripción de cabeza bifurcada 1 (FoxO1) también es desencadenada por la estimulación de la señalización AKT, que promueve la detención del ciclo y la inhibición de la apoptosis en las células de cáncer de mama22,23. En conjunto, la evidencia sólida anterior sugiere que la inhibición de la cascada de señalización PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 puede ser una nueva diana potencial para el tratamiento farmacológico en el cáncer de mama.

Se ha demostrado ampliamente que el salidrósido (Sal) ejerce actividades anticancerígenas 24,25, antihipoxia26,27,28,29 y potenciadoras del sistema inmunológico30. Es un polvo de color marrón claro o marrón que es fácilmente soluble en agua, es un tipo de glucósido feniletanoide y tiene una fórmula de estructura química de C14H 20 O7 y un peso molecular de300.331,32. Las investigaciones farmacológicas modernas han demostrado que la Sal puede promover la apoptosis de las células cancerosas gástricas al restringir la señalización PI3K-AKT-mTOR24. Otras evidencias también sugieren que la supresión de la señalización de PI3K-AKT-HIF-1α por el tratamiento con Sal puede contribuir a la apoptosis de las células cancerosas al mejorar su sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos25. La evidencia también sugiere que la Sal restringe la migración e invasión celular y causa la detención del ciclo al promover la apoptosis en las células MCF-7 del cáncer de mama humano33,34. Sin embargo, queda por ver si Sal puede regular la señalización de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inhibir la proliferación maligna de las células MCF-7. Por lo tanto, este protocolo tuvo como objetivo explorar los efectos de Sal en la migración, invasión, ciclo celular y apoptosis de las células MCF-7 a través de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Las estrategias de investigación integradas que comprenden experimentos convencionales, de bajo costo e independientes, como las evaluaciones de migración e invasión celular, la apoptosis y la detección del ciclo celular por citometría de flujo, la determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y fluorescencia de Ca2+, etc., pueden proporcionar una referencia para el diseño general de experimentos para la investigación anticancerígena con la medicina herbal tradicional. El proceso experimental de este estudio se muestra en la Figura 1.

Protocol

Las células MCF-7 utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). 1. Cultivo celular Cultivar las células MCF-7 en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C con DMEM que contenga un 10% de FBS y un 1% de penicilina (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver la Tabla de Materiales).NOTA: Las células que cubren el 90% del fondo de la placa se emplear…

Representative Results

Efectos de la sal en la inhibición del exceso de proliferación y el retraso de la cicatrización de heridas en células MCF-7Para probar el potencial de la Sal contra el cáncer de mama, primero probamos sus propiedades anticancerígenas mediante ensayos de toxicidad de proliferación celular y arañazos de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama humano. Estas células se co-incubaron con una serie de concentraciones de Sal (5-320 μM) durante 24 h, y la proliferación celular se evaluó mediant…

Discussion

El cáncer de mama afecta a personas de todas las edades y causa una carga física y mental incalculable y una gran presión económica1. El cáncer de mama, con su creciente morbilidad y mortalidad cada año, también ha atraído la atención mundial en cuanto a la búsqueda de terapias compuestas eficaces a base de hierbas más allá de los tratamientos convencionales 4,5. De manera prometedora, una gran cantidad de evidencia ha revelado…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo de la Comisión de Salud de la Provincia de Sichuan (120025).

Materials

1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Pesquisa do Câncer. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Tags

Keywords: SalidrosideMCF-7 CellsBreast CancerPI3K/AKT/HIF-1α/FoxO1 SignalingProliferationMigrationInvasionApoptosisCell CycleROSCa2+Na+-K+-ATPaseCa2+-ATPase
check_url/pt/65634?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image