면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(Digital Image Analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼
Summary
여기에서 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발하여 착상 기간 동안 유산이 재발한 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있도록 검증했습니다.
Abstract
재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 황체 중기 동안 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발 및 검증했습니다. 모든 자궁내막 샘플은 월경 주기의 황체 중기에 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 절단하고, CD56+ uNK 세포, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 면역조직화학(IHC) 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔했으며 정량 분석을 위해 상용 이미지 분석 시스템을 사용했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율은 전체 자궁내막세포의 면역세포 수를 나누어 계산하였다. 상용 영상 분석 시스템을 이용하면 기존의 영상 분석으로는 분석이 어렵거나 불가능했던 자궁내막 면역세포의 정량 평가를 쉽고 정확하게 분석할 수 있습니다. 이 방법론은 면역 세포 간의 상호 작용과 다양한 생식 부전 환자에 대한 이질성을 포함하여 자궁 내막 미세 환경을 정량적으로 특성화하는 데 적용할 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 플랫폼은 RM 환자의 진단 및 치료에 중요한 임상적 중요성을 가질 수 있습니다.
Introduction
재발성 유산(RM)은 두 번 이상의 연속적인 임신을 상실하는 것으로, 최근 몇 년 동안 임상의들의 관심을 끌고 있는 복잡한 질병입니다. 가임기 여성의 RM 발생률은 1%-5%입니다 1. 이전 연구의 결과는 면역 요인이 RM 2,3,4,5의 발병과 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 모체-태아 계면에서 면역 항상성을 유지하는 것은 배아 착상과 발달에 필요합니다. 자궁내막 면역세포는 영양세포 침범 촉진, 나선형 동맥 개조, 태반 발달에 기여하는 등 이러한 항상성을 유지하기 위해 여러 가지 조절 역할을 수행합니다 6,7,8,9.
RM이 있는 여성의 비정상적인 자궁내막 면역 세포는 이전에 보고된 바 있습니다. 결과는 자궁 자연 살해 세포(uNK)의 고밀도와 RM10,11,12의 발생 사이에 밀접한 연관성이 있음을 보여줍니다. RM을 가진 여성의 자궁내막에서 대식세포의 수가 증가한 것으로 보고되었는데, 이는 출산을 한 여성에 비해 증가한 수치이다13. 조절 T 세포(Treg)는 배아에 대한 모계의 면역 관용에 중요한 역할을 하며, RM 환자의 데시두아에서 그 수준과 기능이 감소한다14. 세포독성 T 세포(CTL)와 수지상 세포(DC)도 임신의 면역 조절에 중요한 역할을 합니다15,16. 따라서 황체 중기 동안 국소 자궁내막 면역 세포에 대한 포괄적인 정량 분석은 RM의 발병 기전을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 분석을 위한 일부 현재 방법은 여러 마커를 가진 면역 세포를 정확하게 표지할 수 있는 유세포 분석을 사용합니다17,18. 그러나 유세포 분석의 임상적 적용은 신선한 조직에서만 수행할 수 있기 때문에 제한적입니다. 신선한 조직을 얻는 것은 자궁내막에서 드물게 발생하는 많은 양의 과도한 종양을 사용할 수 있을 때만 가능합니다. 면역조직화학은 조직 형태를 현장에서 잘 관찰할 수 있고 다양한 면역 세포를 표지할 수 있는 반면, 기존의 면역조직화학 기법은 면역 세포의 정량 분석을 수행할 수 없습니다.
기존의 면역조직화학 실험과 비교했을 때, 자궁내막의 면역세포에 대한 정량적 면역조직화학적 분석은 임상적으로 중요한 의미를 지닙니다. IHC 강도 점수는 일반적으로 병리학적 진단 및 연구에서 4점 척도 또는 강하고 약한 것으로 평가됩니다 19,20,21. 그러나 이 반정량적 기법은 주관적이고, 매우 부정확하며, 관찰자 내 및 관찰자 간 변동성이 크다22. 한 가지 가능한 해결책은 기계 학습의 적용이며, 이는 디지털 이미지 분석에서 가치 있는 것입니다23,24. 정량적 측정을 제공함으로써 이 접근법은 자궁 조직 내 면역 세포 침투, 분포 및 밀도를 보다 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 정량적 정보는 월경 주기 및 다양한 병리학적 조건에서 면역 세포 집단의 동적 변화를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, 면역조직화학을 통해 자궁내막의 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 능력은 자궁의 면역 미세환경에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
따라서 이 프로토콜은 RM 환자의 황체 중기 동안 uNK 세포, Tregs, 대식세포, DC 및 세포독성 T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 이미지 분석 플랫폼을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 RM 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축했습니다. 여기에서 RM 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 6개의 자궁내막 면역 마커를 검출했습니다.
황체 중기의 수용성 자궁내막은 성공적인 착상과 임신의 핵심이다27,28. 따라서 자궁내막 면역?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 연구에 동의하고 샘플을 기증한 모든 여성들에게 감사한다.
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
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