Drainerend lymfekliermetastasemodel voor het beoordelen van de dynamiek van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens tumorigenese
Summary
De hier gepresenteerde experimentele opzet biedt een bruikbaar voortplantingsmodel voor de studies van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens lymfekliermetastase (LN), waarbij de verstoring van CD8+ T-cellen van omstanders wordt uitgesloten.
Abstract
Tumorantigeenspecifieke CD8+ T-cellen uit drainerende lymfeklieren krijgen een accumulerend belang bij het opbouwen van een antitumor-immuunrespons tijdens tumorigenese. In veel gevallen vormen kankercellen echter metastatische loci in lymfeklieren voordat ze verder uitzaaien naar verre organen. In hoeverre de lokale en systematische CD8+ T-celresponsen werden beïnvloed door LN-metastasen blijft onduidelijk. Hiertoe hebben we een LN-metastasemodel bij muizen opgezet in combinatie met een B16F10-GP-melanoomcellijn die het surrogaatneoantigeen dat is afgeleid van het lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV), glycoproteïne (GP) en P14-transgene muizen die T-celreceptoren (TCR’s) herbergen die specifiek zijn voor GP-afgeleid peptide GP33-41 , gepresenteerd door het klasse I major histocompatibility complex (MHC)-molecuul H-2Db. Dit protocol maakt het mogelijk om antigeenspecifieke CD8+ T-celresponsen te bestuderen tijdens LN-metastase. In dit protocol werden C57BL/6J-muizen subcutaan geïmplanteerd met B16F10-GP-cellen, gevolgd door adoptieve overdracht met naïeve P14-cellen. Toen de onderhuidse tumor groeide tot een diameter van ongeveer 5 mm, werd de primaire tumor weggesneden en werden B16F10-GP-cellen rechtstreeks in de tumordrainerende lymfeklier (TdLN) geïnjecteerd. Vervolgens werd de dynamiek van CD8+ T-cellen gevolgd tijdens het proces van LN-metastase. Gezamenlijk heeft dit model een benadering geboden om de antigeenspecifieke CD8+ T-cel-immuunresponsen tijdens LN-metastase nauwkeurig te onderzoeken.
Introduction
Kankerimmunotherapie, met name de immuuncheckpointblokkade (ICB), heeft een revolutie teweeggebracht inkankertherapie. ICB blokkeert de co-remmende immunoreceptoren (zoals PD-1, Tim-3, LAG-3 en TIGIT), die sterk tot expressie komen in uitgeputte CD8+ T-cellen in de tumormicro-omgeving (TME), wat leidt tot de revitalisering van uitgeputte CD8+ T-cellen2. Gezien de heterogeniteit van uitgeputte CD8+ T-cellen, bleek uit het verzamelen van bewijs dat tumorspecifieke CD8+ T-cellen afkomstig uit de periferie, inclusief drainerende lymfeklieren (dLN), maar niet in TME, de werkzaamheid van ICB 3,4,5,6,7,8 mediëren. Onlangs werd bevestigd dat van TdLN afgeleide TCF-1+TOX-tumorspecifieke geheugen-CD8+ T-cellen (TdLN-TTSM) de echte responders op ICB zijn, die verschillende functionele eigenschappen van conventionele geheugen-T-cellen belichamen en verder kunnen uitbreiden en differentiëren tot uitgeputte cellen van het nageslacht bij ICB-behandeling9. Al met al bevestigden deze bevindingen het belang van LN bij het opbouwen van antitumorimmuniteit.
Lymfeklieren fungeren als een kritieke plaats bij het vergemakkelijken van de priming en activering van tumorspecifieke CD8+ T-cellen door zowel structurele basis als biologische signalen te leveren10. Verschillende soorten kankercellen zaaien vaak schildwachtklieren (SLN, de eerste LN die een primaire tumor afvoert) voordat ze systematisch worden verspreid11. De aanwezigheid van SLN-metastase is gekoppeld aan een slechte uitkomst bij kanker bij de mens en preklinische modellen toonden aan dat tumorcellen in TdLN zich konden verspreiden naar verre organen via zowel de lymfevaten als de bloedvaten van de knoop 12,13,14,15. SLN-biopsie vertegenwoordigt nu een standaardprocedure om latere behandelingsbeslissingen te begeleiden bij veel solide tumortypes, waardoor onnodige resectie van niet-betrokken LN16,17 zou kunnen worden voorkomen. Zelfs voor de betrokken LN blijft het controversieel of en wanneer chirurgische resectie nodig is, aangezien verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat de verwijdering van regionale LN geen verbeterde algehele overleving vertoonde in vergelijking met degenen die bestraling of systemische therapie kregen zonder regionale LN-resectie18,19. Een interpretatie is dat gemetastaseerd LN (mLN) met microscopische ziekte enig vermogen kan behouden om immuuncellen op te voeden en enkele therapeutische voordelen te bieden. Het is dus van cruciaal belang om op te helderen hoe LN-metastase de antitumor-immuunrespons beïnvloedt, met name de eigenschappen en functies van TdLN-TTSM.
Tot nu toe hebben zowel preklinische als klinische gegevens enkele structurele en cellulaire veranderingen in mLN20 aan het licht gebracht. De dynamische veranderingen van tumorspecifieke CD8+ T-cellen tijdens LN-metastasen zijn echter niet afgebakend. Daarom is het ontwikkelen van een overtuigend model van LN-metastase nodig voor verder onderzoek. Inderdaad, verschillende studies hebben mLN-muismodellen op verschillende manieren gerapporteerd 14,21,22. Spontane metastase in axillaire LN’s werd bijvoorbeeld uitgevoerd door de implantatie van 4T1-borstkankercellen in het borstvetkussen22. In een andere studie genereerden Reticker-Flynn et al. melanoomcellijnen met een hoge incidentie van verspreiding van onderhuidse primaire tumor naar LN’s door seriële inoculatie van tumorcellen gekweekt uit gedissocieerde mLN-weefsels (negen rondes)14. Een ander veelgebruikt model werd bereid door de injectie van tumorcellen in de voetzool en de gemetastaseerde loci zouden worden gevormd in popliteale LN22. Het is met name moeilijk om de precieze tijdstippen van interventie te evalueren, omdat de LN-metastase in deze modellen niet altijd trouw is.
In de huidige studie werd een LN-metastatisch model bij muizen opgesteld door de intranodale injectie van B16F10-GP-cellen23,24, gegenereerd door CRISPR/Cas9-gemedieerde insertie van de gensequentie van het LCMV-virusglycoproteïne (GP) in het genoom van B16F10-cellijn9. Vervolgens werden deze muizen overgebracht met P14-cellen die transgene T-celreceptoren (TCR’s) herbergen, die specifiek het H-2Db GP33-41 epitoop25,26 herkennen en de systemische en lokale dynamiek van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens LN-metastasen kon worden onderzocht. Onze experimentele opzet biedt een bruikbaar model voor de studie van immuunresponsen, met name de antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens de LN-metastase, die de verstoring van CD8+ T-cellen van omstanders uitsluit. Deze resultaten zouden van invloed zijn op de klinische behandelingsopties voor het verwijderen of behouden van het mLN en een nieuw licht werpen op de manipulatie van mLN om maximale therapeutische voordelen te bereiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens tumorigenese overspoelen antigeenpresenterende cellen (APC’s) tumorantigenen en migreren naar TdLN waar ze CD8+ T-cellen primen. Na priming en activering verlaten CD8+ T-cellen het TdLN en infiltreren de tumor om tumorcellen te doden10. Door middel van TdLN-resectie en de toediening van FTY720, die de uitgang van immuuncellen uit de lymfoïde organen blokkeren, hebben verschillende onderzoeken de cruciale rol van TdLN aangetoond bij het waarborgen van de werkzaamheid …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr. 82122028 tot LX), de National Natural Science Foundation of China (nr. 82173094 tot LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr. 2023NSCQ-BHX0087 tot SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
