Modell der drainierenden Lymphknotenmetastasierung zur Beurteilung der Dynamik antigenspezifischer CD8+ T-Zellen während der Tumorentstehung
Summary
Das hier vorgestellte experimentelle Design bietet ein nützliches Reproduktionsmodell für die Untersuchung von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der Metastasierung von Lymphknoten (LN), das die Störung von CD8+ T-Zellen ausschließt.
Abstract
Tumorantigen-spezifische CD8+ T-Zellen aus drainierenden Lymphknoten gewinnen eine zunehmende Bedeutung für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunantwort während der Tumorentstehung. In vielen Fällen bilden Krebszellen jedoch metastasierende Loci in Lymphknoten, bevor sie weiter in entfernte Organe metastasieren. Inwieweit die lokalen und systematischen CD8+ T-Zell-Antworten durch LN-Metastasen beeinflusst wurden, bleibt unklar. Zu diesem Zweck haben wir ein murines LN-Metastasenmodell in Kombination mit einer B16F10-GP-Melanomzelllinie aufgebaut, die das Surrogat-Neoantigen exprimiert, das aus dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV), dem Glykoprotein (GP) und P14-transgenen Mäusen stammt, die T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch für das GP-abgeleitete Peptid GP33-41 sind, das vom Klasse-I-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Molekül H-2Db präsentiert wird. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung antigenspezifischer CD8+ T-Zell-Antworten während der LN-Metastasierung. In diesem Protokoll wurden C57BL/6J-Mäusen subkutan B16F10-GP-Zellen implantiert, gefolgt von einem adoptiven Transfer mit naiven P14-Zellen. Als der subkutane Tumor auf einen Durchmesser von etwa 5 mm anwuchs, wurde der Primärtumor herausgeschnitten und B16F10-GP-Zellen wurden direkt in den tumordrainierenden Lymphknoten (TdLN) injiziert. Anschließend wurde die Dynamik der CD8+ T-Zellen während des Prozesses der LN-Metastasierung überwacht. Insgesamt hat dieses Modell einen Ansatz zur präzisen Untersuchung der antigenspezifischen CD8+ T-Zell-Immunantworten während der LN-Metastasierung geliefert.
Introduction
Die Krebsimmuntherapie, insbesondere die Immun-Checkpoint-Blockade (ICB), hat die Krebstherapie revolutioniert1. ICB blockiert die koinhibitorischen Immunrezeptoren (wie PD-1, Tim-3, LAG-3 und TIGIT), die in erschöpften CD8+ T-Zellen in der Tumormikroumgebung (TME) stark exprimiert werden, was zur Wiederbelebung erschöpfter CD8+ T-Zellen führt2. Unter Berücksichtigung der Heterogenität erschöpfter CD8+ T-Zellen zeigten sich häufende Beweise, dass tumorspezifische CD8+ T-Zellen, die aus der Peripherie stammen, einschließlich drainierender Lymphknoten (dLN), aber nicht in TME, die Wirksamkeit von ICBvermitteln 3,4,5,6,7,8. Kürzlich wurde bestätigt, dass TdLN-abgeleitete TCF-1+TOX-tumorspezifische Gedächtnis-CD8+-T-Zellen (TdLN-TTSM) die echten Responder auf ICB sind, die mehrere funktionelle Eigenschaften herkömmlicher Gedächtnis-T-Zellen verkörpern und sich nach der ICB-Behandlung weiter ausdehnen und zu Nachkommen differenzieren könnten9. Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse die Bedeutung von LN für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunität.
Der Lymphknoten fungiert als kritischer Ort bei der Erleichterung des Primings und der Aktivierung tumorspezifischer CD8+ T-Zellen, indem er sowohl strukturelle Grundlagen als auch biologische Signale bereitstellt10. Mehrere Arten von Krebszellen säen häufig Wächterlymphknoten (SLN, das erste LN, das einen Primärtumor entwässert), bevor sie sich systematisch ausbreiten11. Das Vorhandensein von SLN-Metastasen ist mit einem schlechten Ergebnis bei menschlichem Krebs verbunden, und präklinische Modelle zeigten, dass sich Tumorzellen in TdLN sowohl über die Lymphgefäße als auch über die Blutgefäße des Knotens 12,13,14,15 auf entfernte Organe ausbreiten können. Die SLN-Biopsie stellt heute ein Standardverfahren dar, um spätere Behandlungsentscheidungen bei vielen soliden Tumorarten zu treffen, wodurch eine unnötige Resektion von unbeteiligten LN vermieden werden könnte16,17. Selbst für die betroffenen LN bleibt es umstritten, ob und wann eine chirurgische Resektion erforderlich ist, da mehrere Studien gezeigt haben, dass die Entfernung der regionalen LN kein verbessertes Gesamtüberleben im Vergleich zu denjenigen zeigte, die eine Strahlen- oder systemische Therapie ohne regionale LN-Resektion erhielten18,19. Eine Interpretation ist, dass metastasiertes LN (mLN) mit mikroskopischer Erkrankung eine gewisse Fähigkeit zur Bildung von Immunzellen behalten und einige therapeutische Vorteile bieten kann. Daher ist es von entscheidender Bedeutung zu klären, wie sich die LN-Metastasierung auf die Anti-Tumor-Immunantwort auswirkt, insbesondere auf die Eigenschaften und Funktionen von TdLN-TTSM.
Bisher haben sowohl präklinische als auch klinische Daten einige strukturelle und zelluläre Veränderungen in mLN20 gezeigt. Die dynamischen Veränderungen von tumorspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung wurden jedoch nicht beschrieben. Daher ist die Entwicklung eines überzeugenden Modells der LN-Metastasierung für weitere Untersuchungen erforderlich. In der Tat haben mehrere Studien mLN-Mausmodelle auf unterschiedliche Weise berichtet 14,21,22. Beispielsweise wurde eine spontane Metastasierung in axillären LNs durch die Implantation von 4T1-Brustkrebszellen in das Brustfettpolsterdurchgeführt 22. In einer anderen Studie erzeugten Reticker-Flynn et al. Melanomzelllinien mit hoher Inzidenz der Ausbreitung von subkutanem Primärtumor auf LNs durch serielle Inokulation von Tumorzellen, die aus dissoziierten mLN-Geweben kultiviert wurden (neun Runden)14. Ein weiteres häufig verwendetes Modell wurde durch die Injektion von Tumorzellen in den Fußballen hergestellt, und die metastatischen Loci wurden in poplitealem LN22 gebildet. Insbesondere ist es schwierig, die genauen Zeitpunkte der Intervention zu bewerten, da die LN-Metastasierung in diesen Modellen nicht immer originalgetreu ist.
In der vorliegenden Studie wurde ein murines LN-Metastasierungsmodell durch intranodale Injektion von B16F10-GP-Zellen23,24 etabliert, das durch CRISPR/Cas9-vermittelte Insertion der LCMV-Virus-Glykoprotein-Gensequenz (GP) in das Genom der B16F10-Zelllinie9 erzeugt wurde. Anschließend wurden diese Mäuse mit P14-Zellen übertragen, die transgene T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch das H-2Db GP33-41-Epitop 25,26 erkennen, und die systemische und lokale Dynamik von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung konnte untersucht werden. Unser experimentelles Design bietet ein nützliches Modell für die Untersuchung von Immunantworten, insbesondere der antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung, die die Störung von CD8+ T-Zellen ausschließt. Diese Ergebnisse würden sich auf die klinischen Behandlungsoptionen auswirken, ob das mLN entfernt oder beibehalten werden soll, und ein neues Licht auf die Manipulation von mLN werfen, um einen maximalen therapeutischen Nutzen zu erzielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während der Tumorentstehung verschlingen antigenpräsentierende Zellen (APCs) Tumorantigene und wandern zu TdLN, wo sie CD8+ T-Zellen primen. Nach dem Priming und der Aktivierung verlassen CD8+ T-Zellen das TdLN und infiltrieren den Tumor, um Tumorzellen abzutöten10. Durch die TdLN-Resektion und die Verabreichung von FTY720, die den Austritt von Immunzellen aus den lymphatischen Organen blockieren, haben mehrere Studien die zentrale Rolle von TdLN bei der Sicherstellung der…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (Nr. 82122028 bis LX), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82173094 bis LX), der Natural Science Foundation of Chong Qing (Nr. 2023NSCQ-BHX0087 bis SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
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