ट्यूमरजेनेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए लिम्फ नोड मेटास्टेसिस मॉडल को निकालना
Summary
यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक डिजाइन लिम्फ नोड (एलएन) मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रजनन मॉडल प्रदान करता है, जो बाईस्टैंडर सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गड़बड़ी को बाहर करता है।
Abstract
लिम्फ नोड्स को निकालने से ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं ट्यूमरजेनेसिस के दौरान एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने में एक संचित महत्व प्राप्त करती हैं। हालांकि, कई मामलों में, कैंसर कोशिकाएं दूर के अंगों को आगे मेटास्टेसाइजिंग करने से पहले लिम्फ नोड्स में मेटास्टेटिक लोकी बनाती हैं। एलएन मेटास्टेसिस से स्थानीय और व्यवस्थित सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाएं किस हद तक प्रभावित थीं, यह अस्पष्ट है। यह अंत करने के लिए, हम एक B16F10-GP मेलेनोमा सेल लाइन के साथ संयुक्त एक murine LN मेटास्टेसिस मॉडल स्थापित करते हैं, जो लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिनजाइटिस वायरस (LCMV), ग्लाइकोप्रोटीन (GP), और P14 ट्रांसजेनिक चूहों से प्राप्त सरोगेट नियोएंटीजन को व्यक्त करता है टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) GP-व्युत्पन्न पेप्टाइड GP33-41 के लिए विशिष्ट वर्ग I प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (MHC) अणु H-2Db द्वारा प्रस्तुत किया गया। यह प्रोटोकॉल एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, C57BL/6J चूहों को चमड़े के नीचे B16F10-GP कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था, इसके बाद भोले P14 कोशिकाओं के साथ दत्तक हस्तांतरण किया गया था। जब चमड़े के नीचे का ट्यूमर लगभग 5 मिमी व्यास तक बढ़ गया, तो प्राथमिक ट्यूमर को उत्तेजित किया गया, और B16F10-GP कोशिकाओं को सीधे ट्यूमर ड्रेनिंग लिम्फ नोड (TdLN) में इंजेक्ट किया गया। फिर, एलएन मेटास्टेसिस की प्रक्रिया के दौरान सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता की निगरानी की गई। सामूहिक रूप से, इस मॉडल ने एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सटीक जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान किया है।
Introduction
कैंसर इम्यूनोथेरेपी, विशेष रूप से प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी (आईसीबी), ने कैंसर चिकित्सा1 में क्रांति ला दी है। ICB कॉइनहिबिटरी इम्यूनोरिसेप्टर्स (जैसे PD-1, Tim-3, LAG-3, और TIGIT) को ब्लॉक करता है, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (TME) में थके हुए CD8+ T कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं, जिससे थका हुआ CD8+ T कोशिकाओं का पुनर्जीवनहोता है। थके हुए CD8+ T कोशिकाओं की विषमता को ध्यान में रखते हुए, साक्ष्य जमा करने से पता चला कि परिधि से प्राप्त ट्यूमर-विशिष्ट CD8+ T कोशिकाएं, जिनमें ड्रेनिंग लिम्फ नोड (dLN) शामिल हैं, लेकिन TME में नहीं, ICB 3,4,5,6,7,8की प्रभावकारिता में मध्यस्थता करती हैं। हाल ही में, टीडीएलएन व्युत्पन्न टीसीएफ-1+टीओएक्स-ट्यूमर-विशिष्ट मेमोरी सीडी8+ टी कोशिकाओं (टीडीएलएन-टीटीएसएम) को आईसीबी के वास्तविक उत्तरदाता होने की पुष्टि की गई थी जो पारंपरिक मेमोरी टी कोशिकाओं के कई कार्यात्मक गुणों को मूर्त रूप देते हैं और आईसीबी उपचार9 पर संतान समाप्त कोशिकाओं में आगे विस्तार और अंतर कर सकते हैं। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों ने एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को बढ़ाने में एलएन के महत्व की पुष्टि की।
लिम्फ नोड संरचनात्मक आधार के साथ-साथ जैविक संकेत10प्रदान करके ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के भड़काना और सक्रियण को सुविधाजनक बनाने में एक महत्वपूर्ण स्थान के रूप में कार्य करता है। कई प्रकार के कैंसर कोशिकाएं अक्सर व्यवस्थित प्रसार से पहले प्रहरी लिम्फ नोड (एसएलएन, पहला एलएन प्राथमिक ट्यूमर निकालना) बीजदेती हैं। एसएलएन मेटास्टेसिस की उपस्थिति मानव कैंसर में खराब परिणाम से जुड़ी हुई है और प्रीक्लिनिकल मॉडल से पता चला है कि टीडीएलएन में ट्यूमर कोशिकाएं नोड 12,13,14,15के लसीका वाहिकाओं और रक्त वाहिकाओं दोनों के माध्यम से दूर के अंगों में फैल सकती हैं। एसएलएन बायोप्सी अब कई ठोस ट्यूमर प्रकारों में बाद के उपचार निर्णयों को निर्देशित करने के लिए एक मानक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करती है जो असंबद्ध एलएन 16,17के अनावश्यक लकीर से बच सकती है। यहां तक कि शामिल एलएन के लिए, यह विवादास्पद है कि क्या और जब शल्य चिकित्सा लकीर की जरूरत है के रूप में कई अध्ययनों से पता चला है कि क्षेत्रीय एलएन को हटाने क्षेत्रीय एलएन लकीर18,19 के बिना विकिरण या प्रणालीगत चिकित्सा प्राप्त करने वालों की तुलना में समग्र अस्तित्व में सुधार प्रदर्शन नहीं किया है. एक व्याख्या यह है कि सूक्ष्म रोग के साथ मेटास्टैटिक एलएन (एमएलएन) प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शिक्षित करने और कुछ चिकित्सीय लाभ प्रदान करने की कुछ क्षमता बनाए रख सकता है। इसलिए, यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि एलएन मेटास्टेसिस एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कैसे प्रभावित करता है, विशेष रूप से टीडीएलएन-टीटीएसएम के गुण और कार्य।
अब तक, प्रीक्लिनिकल और क्लिनिकल डेटा दोनों ने एमएलएन20 में कुछ संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तनों का खुलासा किया है। हालांकि, एलएन मेटास्टेसिस के दौरान ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गतिशील परिवर्तनों को चित्रित नहीं किया गया है। इसलिए, आगे की जांच के लिए एलएन मेटास्टेसिस का एक सम्मोहक मॉडल विकसित करना आवश्यक है। दरअसल, कई अध्ययनों ने एमएलएन माउस मॉडल को विभिन्न तरीकोंसे 14,21,22 की सूचना दी है। उदाहरण के लिए, एक्सिलरी एलएन में सहज मेटास्टेसिस स्तन वसा पैड22 में 4 टी 1 स्तन कैंसर कोशिकाओं के आरोपण के माध्यम से आयोजित किया गया था। एक अन्य अध्ययन में, रेटिकर-फ्लिन एट अल ने अलग-अलग एमएलएन ऊतकों (नौ राउंड)14से सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं के धारावाहिक टीकाकरण के माध्यम से चमड़े के नीचे प्राथमिक ट्यूमर से एलएन तक फैलने की उच्च घटनाओं के साथ मेलेनोमा सेल लाइनें उत्पन्न कीं। एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा फुटपैड में तैयार किया गया था और मेटास्टैटिक लोकी पॉप्लिटल एलएन22 में बनाया जाएगा। विशेष रूप से, हस्तक्षेप के सटीक समय बिंदुओं का मूल्यांकन करना मुश्किल है क्योंकि इन मॉडलों में एलएन मेटास्टेसिस हमेशा वफादार नहीं होता है।
वर्तमान अध्ययन में, बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं23,24 के इंट्रानोडल इंजेक्शन के माध्यम से एक मुराइन एलएन मेटास्टैटिक मॉडल स्थापित किया गया था, जो बी 16 एफ 10 सेल लाइन9 के जीनोम में एलसीएमवी वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) जीन अनुक्रम के सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9-मध्यस्थता सम्मिलन द्वारा उत्पन्न किया गया था। फिर, इन चूहों को पी 14 कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित किया गया था जो ट्रांसजेनिक टी सेल रिसेप्टर्स (टीसीआर) को विशेष रूप से एच -2 डीबी जीपी33-41 एपिटोप25,26 को पहचानते हैं और एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रणालीगत और स्थानीय गतिशीलता की जांच की जा सकती है। हमारा प्रयोगात्मक डिजाइन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान करता है, विशेष रूप से एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं जो बाईस्टैंडर सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गड़बड़ी को बाहर करती हैं। ये परिणाम एमएलएन को हटाने या बनाए रखने के नैदानिक उपचार विकल्पों को प्रभावित करेंगे और अधिकतम चिकित्सीय लाभ प्राप्त करने के लिए एमएलएन के हेरफेर पर नई रोशनी डालेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमरजेनेसिस के दौरान, एंटीजन-प्रेजेंटिंग सेल (APCs) ट्यूमर एंटीजन को घेर लेते हैं और TdLN में माइग्रेट हो जाते हैं जहां वे CD8+ T कोशिकाओं को प्राइम करते हैं। भड़काना और सक्रियण के बाद, सीडी 8 + टी कोशिका…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन फॉर आउटस्टैंडिंग यंग स्कॉलर्स ऑफ चाइना (नंबर 82122028 से एलएक्स), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 82173094 से एलएक्स), नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चोंग किंग (नंबर 2023NSCQ-BHX0087 से SW) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
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