Modello di metastasi linfonodali drenanti per la valutazione della dinamica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante la tumorigenesi

Summary

Il disegno sperimentale qui presentato fornisce un utile modello riproduttivo per gli studi delle cellule T CD8⁺ antigene-specifiche durante le metastasi linfonodali (LN), che esclude la perturbazione delle cellule T CD8⁺ astanti.

Abstract

Le cellule T CD8⁺ specifiche dell’antigene tumorale provenienti dai linfonodi drenanti acquisiscono un’importanza crescente nel montare la risposta immunitaria antitumorale durante la tumorigenesi. Tuttavia, in molti casi, le cellule tumorali formano loci metastatici nei linfonodi prima di metastatizzare ulteriormente in organi distanti. Fino a che punto le risposte locali e sistematiche delle cellule T CD8⁺ siano state influenzate dalle metastasi dei LN rimane oscuro. A tal fine, abbiamo messo a punto un modello murino di metastasi LN combinato con una linea cellulare di melanoma B16F10-GP che esprime il neoantigene surrogato derivato dal virus della coriomeningite linfocitaria (LCMV), dalla glicoproteina (GP) e da topi transgenici P14 che ospitano recettori delle cellule T (TCR) specifici per il peptide GP_33-41 derivato da GP presentato dalla molecola del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I H-2D^b. Questo protocollo consente lo studio delle risposte antigene-specifiche delle cellule T CD8⁺ durante le metastasi dei LN. In questo protocollo, i topi C57BL/6J sono stati impiantati per via sottocutanea con cellule B16F10-GP, seguite da trasferimento adottivo con cellule P14 naive. Quando il tumore sottocutaneo è cresciuto fino a circa 5 mm di diametro, il tumore primario è stato asportato e le cellule B16F10-GP sono state iniettate direttamente nel linfonodo drenante del tumore (TdLN). Successivamente, la dinamica delle cellule T CD8⁺ è stata monitorata durante il processo di metastasi dei LN. Collettivamente, questo modello ha fornito un approccio per studiare con precisione le risposte immunitarie delle cellule T CD8⁺ specifiche dell’antigene durante le metastasi dei LN.

Introduction

L’immunoterapia del cancro, in particolare il blocco del checkpoint immunitario (ICB), ha rivoluzionato la terapia del cancro¹. L’ICB blocca gli immunorecettori coinibitori (come PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), che sono altamente espressi nelle cellule T CD8⁺ esauste nel microambiente tumorale (TME), portando al rinvigorimento delle cellule T CD8⁺ esauste². Considerando l’eterogeneità delle cellule T CD8⁺ esaurite, l’accumulo di prove ha rivelato che le cellule T CD8⁺ specifiche del tumore derivate dalla periferia, incluso il linfonodo drenante (dLN), ma non nella TME, mediano l’efficacia dell’ICB 3,4,5,6,7,8. Recentemente, è stato confermato che le cellule T CD8⁺ di memoria tumore-specifiche TCF-1 ^{+ TOX} derivate da TdLN (TdLN-T_TSM) sono le vere risposte all’ICB che incorporano diverse proprietà funzionali delle cellule T di memoria convenzionali e potrebbero ulteriormente espandersi e differenziarsi in cellule esaurite dalla progenie dopo il trattamento con ICB⁹. Nel complesso, questi risultati hanno corroborato l’importanza della LN nel montare l’immunità antitumorale.

Il linfonodo funge da punto critico nel facilitare l’innesco e l’attivazione delle cellule T CD8⁺ specifiche del tumore, fornendo una base strutturale e segnali biologici¹⁰. Diversi tipi di cellule tumorali spesso seminano il linfonodo sentinella (SLN, il primo LN che drena un tumore primario) prima della disseminazione sistematica¹¹. La presenza di metastasi SLN è legata a scarsi risultati nel cancro umano e i modelli preclinici hanno mostrato che le cellule tumorali in TdLN potrebbero diffondersi a organi distanti sia attraverso i vasi linfatici che attraverso i vasi sanguigni dei linfonodi 12,13,14,15. La biopsia SLN rappresenta ora una procedura standard per guidare le successive decisioni terapeutiche in molti tipi di tumori solidi, evitando la resezione non necessaria di LN^16,17 non coinvolti. Anche per i LN coinvolti, rimane controverso se e quando sia necessaria la resezione chirurgica, poiché diversi studi hanno dimostrato che la rimozione dei LN regionali non ha mostrato un miglioramento della sopravvivenza globale rispetto a quelli che hanno ricevuto radioterapia o terapia sistemica senza resezione regionale^18,19. Un’interpretazione è che la LN metastatica (mLN) con malattia microscopica possa mantenere una certa capacità di educare le cellule immunitarie e fornire alcuni benefici terapeutici. Quindi, è di fondamentale importanza chiarire come le metastasi di LN influenzino la risposta immunitaria antitumorale, in particolare le proprietà e le funzioni di TdLN-T_TSM.

Fino ad ora, sia i dati preclinici che quelli clinici hanno rivelato alcune alterazioni strutturali e cellulari in mLN²⁰. Tuttavia, i cambiamenti dinamici delle cellule T CD8⁺ tumore-specifiche durante le metastasi dei LN non sono stati delineati. Pertanto, lo sviluppo di un modello convincente di metastasi LN è necessario per ulteriori indagini. In effetti, diversi studi hanno riportato modelli murini mLN in modi diversi 14,21,22. Ad esempio, le metastasi spontanee nei LN ascellari sono state condotte attraverso l’impianto di cellule di carcinoma mammario 4T1 nel cuscinetto adiposo^{mammario 22}. In un altro studio, Reticker-Flynn et al. hanno generato linee cellulari di melanoma con un’elevata incidenza di diffusione dal tumore primario sottocutaneo ai LN attraverso l’inoculazione seriale di cellule tumorali coltivate da tessuti mLN dissociati (nove round)¹⁴. Un altro modello comunemente usato è stato preparato mediante l’iniezione di cellule tumorali nel cuscinetto plantare e i loci metastatici si sarebbero formati nel LN²² popliteo. In particolare, è difficile valutare i tempi precisi dell’intervento perché le metastasi dei LN in questi modelli non sono sempre fedeli.

Nel presente studio, è stato stabilito un modello metastatico murino di LN attraverso l’iniezione intranodale di cellule B16F10-GP^23,24, generate dall’inserzione mediata da CRISPR/Cas9 della sequenza genica della glicoproteina del virus LCMV (GP) nel genoma della linea cellulare^{B16F10 9}. Quindi, questi topi sono stati trasferiti con cellule P14 che ospitano recettori transgenici delle cellule T (TCR) che riconoscono specificamente l’epitopo H-2D^b GP_33-41 ^25,26 e la dinamica sistemica e locale delle cellule T CD8⁺ antigene-specifiche durante le metastasi LN potrebbe essere studiata. Il nostro disegno sperimentale fornisce un modello utile per lo studio delle risposte immunitarie, in particolare delle cellule T CD8⁺ antigene-specifiche durante le metastasi dei LN che esclude la perturbazione delle cellule T CD8⁺ astanti. Questi risultati influenzerebbero le opzioni di trattamento clinico sull’opportunità di rimuovere o trattenere l’mLN e getterebbero nuova luce sulla manipolazione dell’mLN per ottenere i massimi benefici terapeutici.

Protocol

I topi C57BL/6J (riferiti ai topi B6) e i topi transgenici naïve P14 9,27 utilizzati avevano un’età compresa tra 6 e 10 settimane e un peso di 18-22 g. Sia i maschi che le femmine sono stati inclusi senza randomizzazione o accecamento. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali dell’Università Agraria di Qingdao. 1. Preparazio…

Representative Results

Il diagramma schematico di questo disegno sperimentale è mostrato nella Figura 1A. Un totale di 5 x 105 cellule B16F10-GP in 100 μL di PBS sono state impiantate per via sottocutanea (s.c.) nella regione inguinale bilaterale di topi CD45.2 C57BL/6J. Dopo 7 giorni, a questi topi portatori di tumore è stata iniettata per via intraperitoneale (i.p.) 4 mg di CTX, seguita dal trasferimento adottivo di 5 x 105 cellule CD45.1+P14 attraverso l’iniezione endovenosa …

Discussion

Durante la tumorigenesi, le cellule presentanti l’antigene (APC) inghiottono gli antigeni tumorali e migrano verso TdLN dove innescano le cellule T CD8⁺. Dopo l’innesco e l’attivazione, le cellule T CD8⁺ lasciano il TdLN e si infiltrano nel tumore per uccidere le cellule tumorali¹⁰. Attraverso la resezione di TdLN e la somministrazione di FTY720 che bloccano l’uscita delle cellule immunitarie dagli organi linfoidi, diversi studi hanno dimostrato il ruolo fondamentale di TdLN …

Materials

1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml