Drenerende lymfeknutemetastasemodell for å vurdere dynamikken til antigenspesifikke CD8+ T-celler under tumorigenese

Summary

Den eksperimentelle designen som presenteres her gir en nyttig reproduksjonsmodell for studier av antigenspesifikke CD8⁺ T-celler under lymfeknute (LN) metastase, som utelukker forstyrrelse av tilskuer-CD8⁺ T-celler.

Abstract

Tumorantigenspesifikke CD8⁺ T-celler fra drenerende lymfeknuter får en akkumulerende betydning ved montering av antitumorimmunrespons under tumorigenese. Imidlertid danner kreftceller i mange tilfeller metastatiske loci i lymfeknuter før de metastaserer videre til fjerne organer. I hvilken grad de lokale og systematiske CD8⁺ T-celleresponsene ble påvirket av LN-metastase, er fortsatt uklart. For dette formål satte vi opp en murine LN-metastasemodell kombinert med en B16F10-GP melanomcellelinje som uttrykker surrogatneoantigenet avledet fra lymfocytisk choriomeningittvirus (LCMV), glykoprotein (GP) og P14 transgene mus som har T-cellereseptorer (TCR) som er spesifikke for GP-avledet peptid GP_33-41 presentert av klasse I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H-2D^b. Denne protokollen gjør det mulig å studere antigenspesifikke CD8⁺ T-celleresponser under LN-metastase. I denne protokollen ble C57BL/6J-mus subkutant implantert med B16F10-GP-celler, etterfulgt av adoptivoverføring med naive P14-celler. Da subkutan tumor vokste til ca. 5 mm i diameter, ble primærtumor skåret ut, og B16F10-GP-celler ble injisert direkte i tumordrenerende lymfeknute (TdLN). Deretter ble dynamikken til CD8 ⁺ T-celler overvåket under prosessen med LN-metastase. Samlet har denne modellen gitt en tilnærming til nøyaktig å undersøke de antigenspesifikke CD8 ⁺ T-celleimmunresponsene under LN-metastase.

Introduction

Kreftimmunterapi, spesielt immunsjekkpunktblokaden (ICB), har revolusjonert kreftbehandling¹. ICB blokkerer de koinhibitoriske immunreseptorene (som PD-1, Tim-3, LAG-3 og TIGIT), som er sterkt uttrykt i utmattede CD8 ⁺ T-celler i tumormikromiljøet (TME), noe som fører til gjenopplivning av utmattede CD8 ⁺ T-celler². Tatt i betraktning heterogeniteten til utmattede CD8 ⁺ T-celler, viste akkumulerende bevis at tumorspesifikke CD8 ⁺ T-celler avledet fra periferien, inkludert drenering av lymfeknute (dLN), men ikke i TME, medierer effekten av ICB 3,4,5,6,7,8. Nylig ble TdLN-avledede TCF-1 ⁺ TOX-tumorspesifikke CD8 ⁺ T-celler (TdLN-T_TSM) bekreftet å være de ekte responderne på ICB som legemliggjør flere funksjonelle egenskaper til konvensjonelle minne T-celler og kan ytterligere utvide og differensiere til avkom, utmattede celler ved ICB-behandling⁹. Samlet sett bekreftet disse funnene betydningen av LN i montering av antitumorimmunitet.

Lymfeknute fungerer som et kritisk sted for å lette priming og aktivering av tumorspesifikke CD8 ⁺ T-celler ved å gi strukturelt grunnlag så vel som biologiske signaler¹⁰. Flere typer kreftceller frø ofte vaktpostlymfeknute (SLN, den første LN som drenerer en primærtumor) før systematisk spredning¹¹. Tilstedeværelsen av SLN-metastase er knyttet til dårlig utfall i human kreft, og prekliniske modeller viste at tumorceller i TdLN kunne spre seg til fjerne organer gjennom både lymfekar og blodkar i noden 12,13,14,15. SLN-biopsi representerer nå en standardprosedyre for å veilede etterfølgende behandlingsbeslutninger i mange solide tumortyper som kan unngå unødvendig reseksjon av uinvolvert LN^16,17. Selv for den involverte LN er det fortsatt kontroversielt om og når kirurgisk reseksjon er nødvendig, da flere studier har vist at fjerning av regional LN ikke viste forbedret totaloverlevelse sammenlignet med de som fikk stråling eller systemisk behandling uten regional ^{LN-reseksjon 18,19}. En tolkning er at metastatisk LN (mLN) med mikroskopisk sykdom kan beholde en viss kapasitet til å utdanne immunceller og gi noen terapeutiske fordeler. Så det er kritisk viktig å belyse hvordan LN-metastase påvirker antitumorimmunresponsen, spesielt egenskapene og funksjonene til TdLN-T_TSM.

Hittil har både prekliniske og kliniske data avslørt noen strukturelle og cellulære endringer i mLN²⁰. Imidlertid er de dynamiske endringene av tumorspesifikke CD8 ⁺ T-celler under LN-metastase ikke avgrenset. Derfor er det nødvendig å utvikle en overbevisende modell for LN-metastase for videre undersøkelse. Faktisk har flere studier rapportert mLN musemodeller på forskjellige måter 14,21,22. For eksempel ble spontan metastase i aksillære LN utført ved implantasjon av 4T1 brystkreftceller i brystfettputen²². I en annen studie genererte Reticker-Flynn et al. melanomcellelinjer med høy forekomst av spredning fra subkutan primærtumor til LN gjennom seriell inokulering av tumorceller dyrket fra dissosiert mLN-vev (ni runder)¹⁴. En annen vanlig modell ble utarbeidet ved injeksjon av tumorceller i fotputen, og metastatiske loci ville bli dannet i popliteal LN²². Spesielt er det vanskelig å evaluere de nøyaktige tidspunktene for intervensjon fordi LN-metastase i disse modellene ikke alltid er trofast.

I denne studien ble en murine LN-metastatisk modell etablert gjennom intranodal injeksjon av B16F10-GP-celler^23,24, generert ved CRISPR/Cas9-mediert innsetting av LCMV-virusglykoprotein (GP) gensekvens i genomet til B16F10-cellelinje⁹. Deretter ble disse musene overført med P14-celler som har transgene T-cellereseptorer (TCR) som spesifikt gjenkjenner H-2D^b GP_{33-41-epitopen} ^25,26 og den systemiske og lokale dynamikken til antigenspesifikke CD8 ⁺ T-celler under LN-metastase kunne undersøkes. Vår eksperimentelle design gir en nyttig modell for studiet av immunresponser, spesielt de antigenspesifikke CD8 ⁺ T-cellene under LN-metastasen som utelukker forstyrrelsen av tilskuer-CD8 ⁺ T-celler. Disse resultatene vil påvirke de kliniske behandlingsalternativene for å fjerne eller beholde mLN og kaste nytt lys over manipulering av mLN for å oppnå maksimal terapeutisk nytte.

Protocol

C57BL/6J-musene (referert til B6-mus) og naive P14-transgene mus 9,27 som ble brukt var 6-10 ukers alder som veide 18-22 g. Både mann og kvinne ble inkludert uten randomisering eller blinding. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Qingdao Agricultural University. 1. Fremstilling av medium og reagenser Forbered B16F10-GP melanom cellekul…

Representative Results

Det skjematiske diagrammet til dette eksperimentelle designet er vist i figur 1A. Totalt 5 x 105 B16F10-GP-celler i 100 μL PBS ble subkutant (s.c.) implantert i den bilaterale lyskeregionen av CD45.2 C57BL/6J-mus. Etter 7 dager ble disse tumorbærende musene intraperitonealt (i.p.) injisert med 4 mg CTX, etterfulgt av adoptivoverføring av 5 x 105 CD45.1 + P14-celler gjennom intravenøs injeksjon i halen. Ved tumorvekst til ca. 3-5 mm i diameter (ca. 7 dager…

Discussion

Under tumorigenese sluker antigenpresenterende celler (APCer) tumorantigener og migrerer til TdLN hvor de primer CD8 ⁺ T-celler. Etter priming og aktivering forlater CD8 ⁺ T-celler TdLN og infiltrerer svulsten for å drepe tumorceller¹⁰. Gjennom TdLN-reseksjon og administrering av FTY720 som blokkerer utgangen av immunceller fra lymfoide organer, har flere studier vist den sentrale rollen til TdLN for å sikre effekten av PD-1 / PD-L1 sjekkpunktbehandling^34,…

Materials

1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml