Dränerande lymfkörtelmetastasmodell för att bedöma dynamiken hos antigenspecifika CD8+ T-celler under tumörbildning
Summary
Den experimentella designen som presenteras här ger en användbar reproduktionsmodell för studier av antigenspecifika CD8+ T-celler under lymfkörtelmetastaser (LN), vilket utesluter störning av åskådare CD8+ T-celler.
Abstract
Tumörantigenspecifika CD8+ T-celler från dränerande lymfkörtlar får en ackumulerande betydelse för att öka antitumörimmunsvaret under tumörbildning. Men i många fall bildar cancerceller metastaserande loci i lymfkörtlarna innan de metastaserar vidare till avlägsna organ. I vilken utsträckning de lokala och systematiska CD8+ T-cellssvaren påverkades av LN-metastaser är fortfarande höljt i dunkel. För detta ändamål satte vi upp en murin LN-metastaseringsmodell kombinerad med en B16F10-GP melanomcellinje som uttrycker surrogatneoantigenet som härrör från lymfocytiskt koriomeningitvirus (LCMV), glykoprotein (GP) och P14-transgena möss som hyser T-cellsreceptorer (TCR) specifika för GP-härledd peptid GP33-41 som presenteras av klass I major histocompatibility complex (MHC) molekylen H-2Db. Detta protokoll möjliggör studier av antigenspecifika CD8+ T-cellssvar under LN-metastaser. I detta protokoll implanterades C57BL/6J-möss subkutant med B16F10-GP-celler, följt av adoptiv överföring med naiva P14-celler. När den subkutana tumören växte till cirka 5 mm i diameter avlägsnades den primära tumören och B16F10-GP-celler injicerades direkt i tumördränerande lymfkörteln (TdLN). Därefter övervakades dynamiken hos CD8+ T-celler under processen för LN-metastasering. Sammantaget har denna modell tillhandahållit ett tillvägagångssätt för att exakt undersöka de antigenspecifika CD8+ T-cellsimmunsvaren under LN-metastaser.
Introduction
Immunterapi mot cancer, särskilt immuncheckpointblockaden (ICB), har revolutionerat cancerterapin1. ICB blockerar de kohibitoriska immunreceptorerna (t.ex. PD-1, Tim-3, LAG-3 och TIGIT), som uttrycks i hög grad i utmattade CD8+ T-celler i tumörmikromiljön (TME), vilket leder till att utmattade CD8+ T-celleråterupplivas. Med tanke på heterogeniteten hos utmattade CD8+ T-celler, visade ackumulerade bevis att tumörspecifika CD8+ T-celler som härrör från periferin, inklusive dränerande lymfkörtlar (dLN), men inte i TME, medierar effekten av ICB 3,4,5,6,7,8. Nyligen bekräftades att TdLN-härledda TCF-1+TOX-tumörspecifika minnes-CD8+ T-celler (TdLN-TTSM) är de som verkligen svarar på ICB som förkroppsligar flera funktionella egenskaper hos konventionella minnes-T-celler och som ytterligare kan expandera och differentiera till avkommeutmattade celler vid ICB-behandling9. Sammantaget bekräftade dessa fynd vikten av LN för att öka antitumörimmuniteten.
Lymfkörteln fungerar som en kritisk plats för att underlätta priming och aktivering av tumörspecifika CD8+ T-celler genom att tillhandahålla strukturell bas såväl som biologiska signaler10. Flera typer av cancerceller befruktar ofta portvaktslymfkörtlar (SLN, det första LN som dränerar en primärtumör) innan de systematiskt sprids11. Förekomsten av SLN-metastaser är kopplad till dåligt utfall i human cancer och prekliniska modeller visade att tumörceller i TdLN kunde sprida sig till avlägsna organ genom både lymfkärlen och blodkärlen i noden 12,13,14,15. SLN-biopsi utgör nu en standardprocedur för att vägleda efterföljande behandlingsbeslut i många solida tumörtyper, vilket kan undvika onödig resektion av oinvolverad LN16,17. Även för den inblandade LN är det fortfarande kontroversiellt om och när kirurgisk resektion behövs eftersom flera studier har visat att avlägsnandet av regionalt LN inte uppvisade förbättrad total överlevnad jämfört med dem som fick strålning eller systemisk behandling utan regional LN-resektion18,19. En tolkning är att metastaserande LN (mLN) med mikroskopisk sjukdom kan behålla en viss förmåga att utbilda immunceller och ge vissa terapeutiska fördelar. Så det är mycket viktigt att klarlägga hur LN-metastaser påverkar immunsvaret mot tumörer, särskilt egenskaperna och funktionerna hos TdLN-TTSM.
Hittills har både prekliniska och kliniska data avslöjat vissa strukturella och cellulära förändringar i mLN20. De dynamiska förändringarna av tumörspecifika CD8+ T-celler under LN-metastasering har dock inte avgränsats. Därför behövs det att utveckla en övertygande modell för LN-metastaser för vidare forskning. Faktum är att flera studier har rapporterat mLN-musmodeller på olika sätt 14,21,22. Till exempel genomfördes spontan metastasering i axillära LN genom implantation av 4T1-bröstcancerceller i bröstfettkudden22. I en annan studie genererade Reticker-Flynn et al. melanomcellinjer med hög förekomst av spridning från subkutan primärtumör till LN genom seriell inokulering av tumörceller odlade från dissocierade mLN-vävnader (nio omgångar)14. En annan vanligt förekommande modell framställdes genom injektion av tumörceller i fotplattan och de metastaserande loci skulle bildas i popliteal LN22. Framför allt är det svårt att utvärdera de exakta tidpunkterna för interventionen eftersom LN-metastasering i dessa modeller inte alltid är trogen.
I den aktuella studien etablerades en murin LN-metastaseringsmodell genom intranodal injektion av B16F10-GP-celler23,24, genererad genom CRISPR/Cas9-medierad insättning av LCMV-virusglykoprotein (GP) gensekvens i genomet hos B16F10-cellinje 9. Sedan överfördes dessa möss med P14-celler som hyser transgena T-cellsreceptorer (TCR) som specifikt känner igen H-2Db GP33-41-epitopen 25,26 och den systemiska och lokala dynamiken hos antigenspecifika CD8+ T-celler under LN-metastasering kunde undersökas. Vår experimentella design ger en användbar modell för studier av immunsvar, särskilt de antigenspecifika CD8+ T-cellerna under LN-metastaseringen, vilket utesluter störning av åskådar-CD8+ T-celler. Dessa resultat skulle påverka de kliniska behandlingsalternativen för att ta bort eller behålla mLN och kasta nytt ljus över manipulationen av mLN för att uppnå maximala terapeutiska fördelar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under tumörgenes uppslukar antigenpresenterande celler (APC) tumörantigener och migrerar till TdLN där de primar CD8+ T-celler. Efter priming och aktivering lämnar CD8+ T-celler TdLN och infiltrerar tumören för att döda tumörceller10. Genom TdLN-resektion och administrering av FTY720 som blockerar immuncellernas utträde från lymfoida organ, har flera studier visat den centrala roll som TdLN spelar för att säkerställa effekten av PD-1/PD-L1 checkpointterapi<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr 82122028 till LX), National Natural Science Foundation of China (nr 82173094 till LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr 2023NSCQ-BHX0087 till SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
