Analyse de la fonction mitochondriale chez un mutantB9-Null de Drosophila melanogaster PINK1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution
Summary
Nous présentons ici un protocole de respirométrie à haute résolution pour analyser la bioénergétique chez les mouches des fruits mutantes PINK1B9-null. La méthode utilise le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Les maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), et les perturbations cellulaires telles que le cancer sont quelques-uns des troubles qui perturbent le métabolisme énergétique avec une altération des fonctions mitochondriales. Les mitochondries sont des organites qui contrôlent à la fois le métabolisme énergétique et les processus cellulaires impliqués dans la survie et la mort cellulaires. Pour cette raison, les approches d’évaluation de la fonction mitochondriale peuvent offrir des informations importantes sur les conditions cellulaires dans les processus pathologiques et physiologiques. À cet égard, les protocoles de respirométrie à haute résolution (HRR) permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques. De plus, l’étude de la physiologie mitochondriale et de la bioénergétique nécessite des modèles génétiquement et expérimentalement traitables tels que Drosophila melanogaster.
Ce modèle présente plusieurs avantages, tels que sa similitude avec la physiologie humaine, son cycle de vie rapide, sa facilité d’entretien, sa rentabilité, ses capacités de débit élevées et un nombre réduit de préoccupations éthiques. Ces attributs en font collectivement un outil inestimable pour disséquer des processus cellulaires complexes. Le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale à l’aide du mutantB9-null de Drosophila melanogaster PINK1. Le gène pink1 est responsable du codage de la kinase présumée 1 induite par PTEN, par un processus reconnu sous le nom de mitophagie, qui est crucial pour l’élimination des mitochondries dysfonctionnelles du réseau mitochondrial. Des mutations de ce gène ont été associées à une forme familiale autosomique récessive précoce de la maladie de Parkinson. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial impliqué dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson.
Introduction
Les mitochondries sont des organites cellulaires qui contrôlent des fonctions importantes, notamment la régulation apoptotique, l’homéostasie calcique et la participation aux voies de biosynthèse. En possédant du matériel génétique autonome, ils sont capables de contribuer aux processus de maintenance et de réparation cellulaires. Leur structure abrite la chaîne de transport d’électrons et la phosphorylation oxydative, toutes deux cruciales pour l’énergie cellulaire 1,2,3. En particulier, le contrôle de l’énergie est obtenu grâce à la production d’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS)2. La perturbation du métabolisme énergétique avec altération des fonctions mitochondriales se produit à la fois dans la survie et la mortcellulaire4,5, fréquemment associée à un large éventail de pathologies humaines, telles que le cancer, et les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)3,6.
La maladie de Parkinson est un trouble chronique, progressif et neurologique. La cause principale de cette maladie est la mort des cellules cérébrales, en particulier dans la substance noire, qui sont responsables de la production du neurotransmetteur dopamine, qui contrôle le mouvement 6,7,8. La première observation qui a lié le parkinsonisme au dysfonctionnement mitochondrial a été faite en 1988, dans des modèles expérimentaux utilisant des toxines qui inhibent la chaîne respiratoire Complexe I9.
À l’heure actuelle, il existe plusieurs méthodes pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial 10,11,12,1 3 ; cependant, par rapport aux approches conventionnelles, la respirométrie à haute résolution (HRR) présente une sensibilité et des avantages supérieurs13,14. Par exemple, les protocoles HRR permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques14,15. Les dysfonctionnements mitochondriaux peuvent être évalués dans des cellules intactes, des mitochondries isolées, ou même ex vivo 10,11,13,14.
Les dysfonctionnements mitochondriaux sont étroitement associés à de nombreux processus pathologiques et physiologiques. Il est donc important d’étudier la physiologie mitochondriale et la bioénergétique à l’aide de systèmes modèles génétiquement et expérimentalement traitables. À cet égard, la recherche sur Drosophila melanogaster, la mouche des fruits, présente plusieurs avantages. Ce modèle partage des caractéristiques et des processus cellulaires fondamentaux avec les humains, y compris l’utilisation de l’ADN comme matériel génétique, des organites communs et des voies moléculaires conservées impliquées dans le développement, l’immunité et la signalisation cellulaire. De plus, les mouches des fruits ont un cycle de vie rapide, un entretien facile, un faible coût, un débit élevé et moins de préoccupations éthiques, constituant ainsi un outil inestimable pour disséquer les processus cellulaires complexes 16,17,18,19,20.
De plus, un homologue du gène de la kinase 1 putative induite par PTEN (pink1) est exprimé chez D. melanogaster. Il joue un rôle crucial dans l’élimination des mitochondries endommagées par le processus de mitophagie8. Chez l’homme, les mutations de ce gène prédisposent les individus à une forme familiale autosomique récessive de la maladie de Parkinson associée à un dysfonctionnement mitochondrial 8,21,22,23. Par conséquent, la mouche des fruits est un modèle animal puissant pour les études sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson et le criblage de candidats-médicaments axés sur le dysfonctionnement mitochondrial et la bioénergétique. Par conséquent, le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale dans un modèle de MP de D. melanogaster en utilisant la technique HRR dans l’OROBOROS avec le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Protocol
Representative Results
Discussion
La HRR est une technique puissante pour étudier la respiration mitochondriale et le métabolisme énergétique chez D. melanogaster et d’autres organismes. Il fournit une évaluation détaillée et quantitative de la fonction mitochondriale, permettant aux chercheurs de mieux comprendre la bioénergétique des cellules. Le protocole présenté ici décrit l’évaluation de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale et de l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques à l’aide du protoco…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient l’agence brésilienne Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) et T.D. (#88887.512883/2020-00) sont récipiendaires d’une bourse de recherche.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
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