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Bioquímica

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65664
, ,
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences,Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry,Federal University of Santa Maria

Summary

여기서는 PINK1B9-null 돌연변이 초파리의 생체 에너지를 분석하기 위한 고분해능 호흡 측정 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용합니다.

Abstract

파킨슨병(PD)을 포함한 신경퇴행성 질환과 암과 같은 세포 장애는 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사를 방해하는 질환 중 일부입니다. 미토콘드리아는 세포 소기관으로, 에너지 대사와 세포 생존 및 사멸에 관여하는 세포 과정을 모두 조절합니다. 이러한 이유로 미토콘드리아 기능을 평가하는 접근법은 병리학적 및 생리학적 과정에서 세포 상태에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이와 관련하여 고분해능 호흡 측정법(HRR) 프로토콜을 통해 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활동을 평가할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 생리학 및 생체 에너지학을 연구하려면 Drosophila melanogaster와 같은 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델이 필요합니다.

이 모델은 인간 생리학과의 유사성, 빠른 수명 주기, 쉬운 유지 관리, 비용 효율성, 높은 처리량 기능 및 최소화된 윤리적 문제와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 특성은 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구로 총체적으로 설정됩니다. 본 연구는 Drosophila melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 이용하여 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명한다. pink1 유전자는 미토콘드리아 네트워크에서 기능 장애를 일으키는 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 미토파지로 인식되는 과정을 통해 PTEN에 의해 유도된 추정 키나아제 1을 암호화하는 역할을 합니다. 이 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 조기 발병 가족성 PD와 관련이 있습니다. 이 모델은 PD의 병태생리학과 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

미토콘드리아는 세포사멸 조절, 칼슘 항상성, 생합성 경로 참여 등 중요한 기능을 조절하는 세포 소기관입니다. 자율적인 유전 물질을 소유함으로써 세포 유지 및 복구 과정에 기여할 수 있습니다. 그들의 구조는 세포 에너지 1,2,3에 중요한 전자 수송 사슬과 산화적 인산화를 수용합니다. 특히, 산화적 인산화(OXPHOS)를 통한 아데노신 삼인산(ATP) 생산을 통해 에너지 제어가 이루어집니다2. 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사 장애는 세포의 생존과 사멸 모두에서 발생하며4,5 암과 같은 광범위한 인체 병리학 및 파킨슨병(PD)3,6과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다.

파킨슨병은 만성, 진행성, 신경학적 장애입니다. 이 질병의 주요 원인은 뇌 세포의 죽음이며, 특히 운동을 조절하는 신경 전달 물질 도파민의 생산을 담당하는 흑질의 사멸입니다 6,7,8. 파킨슨병과 미토콘드리아 기능 장애를 연관 짓는 최초의 관찰은 1988년 호흡 사슬 복합체 I9를 억제하는 독소를 사용한 실험 모델에서 이루어졌습니다.

현재 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법에는 여러 가지가 있다 10,11,12,1 3; 그러나 기존 접근법에 비해 고분해능 호흡 측정법(HRR)은 우수한 감도와 이점을 제공합니다13,14. 예를 들어, HRR 프로토콜은 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평가할 수 있다(14,15). 미토콘드리아 기능 장애는 온전한 세포, 분리된 미토콘드리아 또는 생체 외10,11,13,14에서 평가할 수 있습니다.

미토콘드리아 기능 장애는 많은 병리학적 및 생리학적 과정과 밀접한 관련이 있습니다. 따라서 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학을 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델 시스템을 사용하여 연구하는 것이 중요합니다. 이와 관련하여 초파리인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에 대한 연구는 몇 가지 장점이 있습니다. 이 모델은 DNA를 유전 물질로 사용하는 것, 공통 세포 기관, 발달, 면역 및 세포 신호 전달에 관여하는 보존된 분자 경로를 포함하여 기본적인 세포 특성과 과정을 인간과 공유합니다. 또한, 초파리는 빠른 생애 주기, 쉬운 유지 보수, 저렴한 비용, 높은 처리량 및 적은 윤리적 문제를 가지고 있으므로 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구를 구성합니다 16,17,18,19,20.

또한, PTEN-유도된 추정 키나아제 1(pink1) 유전자의 상동체가 D. melanogaster에서 발현됩니다. 미토파지 과정을 통해 손상된 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 역할을 합니다8. 인간의 경우, 이 유전자의 돌연변이는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 상염색체 열성 가족성 형태의 PD에 걸리기 쉽다 8,21,22,23. 결과적으로, 초파리는 PD의 병태생리학 연구와 미토콘드리아 기능 장애 및 생체 에너지학에 중점을 둔 약물 후보 물질의 스크리닝을 위한 강력한 동물 모델입니다. 따라서 본 연구는 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용하여 OROBOROS에서 HRR 기술을 사용하여 D. melanogaster의 PD 모델에서 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명합니다.

Protocol

블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center, ID 번호: 34749)의 w 1118(흰색) 및 w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9로 지칭)(FlyBase ID: FBgn0029891) 균주를 사용했습니다. 이 연구에서는 수컷 D. melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 대조군(유전적 배경)으로 사용되는 w1118 균주의 수컷 D. melanogaster와 비교합니다. 다른 파라미터는 호흡…

Representative Results

여기서, OXPHOS CI (P = 0.0341) 및 OXPHOS CI &II (P = 0.0392) 상태에서의 O2 플럭스는 대조 파리와 비교할 때 PINK1B9 null fly에서 감소됩니다 (그림 4). 이 결과는 우리 그룹29,30의 이전 결과에서도 관찰되었습니다. CI와 CII는 전자 수송 시스템(ETS)의 핵심 구성 요소로, CI는 NADH에서 유비퀴논…

Discussion

HRR은 D. melanogaster 및 기타 유기체의 미토콘드리아 호흡 및 에너지 대사를 연구하는 강력한 기술입니다. 미토콘드리아 기능에 대한 상세하고 정량적인 평가를 제공하여 연구원들이 세포의 생체 에너지학에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 D. melanogaster의 SUIT 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 및 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 브라질 기관인 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)를 인정합니다. PM(#88887.512821/2020-00) 및 TD(#88887.512883/2020-00)는 연구 펠로우십 수혜자입니다.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7
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Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).
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