הפלת FAM83A כדי לאמת את תפקידו בצמיחת תאי סרטן צוואר הרחם וברגישות לציספלטין
Summary
כאן, אנו מציגים את ההליכים עבור FAM83A knockdown; הבדיקות לאיתור השפעותיו על התפשטות, הגירה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם; ואת הרגישות של תאים אלה כדי cisplatin. מחקר זה מספק גן מטרה מבטיח לסרטן צוואר הרחם והפניה למחקר תרופתי נוסף.
Abstract
חקר גני המטרה של הגידול הוא בעל חשיבות עליונה למניעה וטיפול בסרטן צוואר הרחם. במחקר זה, אנו מתארים את השלבים הכרוכים בזיהוי גן מטרה לגידול FAM83A בסרטן צוואר הרחם. ראשית, מערך הנתונים של אטלס גנום הסרטן שימש כדי לאמת את הביטוי ואת המשמעות הפרוגנוסטית של FAM83A אצל נשים. RNA מפריע קטן (siRNA) שימש להפלה של הגן FAM83A בתאי HeLa ו-C33a . לאחר מכן, 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) צביעה בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על יכולות ההתרבות של תאי הגידול. ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי בוצעו כדי להעריך את נדידת תאי הגידול ואת יכולות הפלישה.
כתם מערבי שימש לכימות רמות חלבון הקשורות לאפופטוזיס. צביעת JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. יתר על כן, נעשה שימוש בהתערבות cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP) כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של גן המטרה. בדיקות ציטומטריית זרימה והיווצרות מושבה נערכו כדי לאמת עוד יותר את המאפיינים האנטי-סרטניים של הגן. כתוצאה מכך, הוכח כי FAM83A מעכב התפשטות, נדידה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם וגורם לרגישות תאים אלה לציספלטין. מתודולוגיות מקיפות אלה מאמתות באופן קולקטיבי את FAM83A כגן מטרה הקשור לגידול, וטומנות בחובן הבטחה כיעד טיפולי פוטנציאלי במניעה ובטיפול בסרטן צוואר הרחם.
Introduction
סרטן צוואר הרחם הוא דאגה עולמית מכיוון שהוא אחד הסוגים המובילים של ממאירות גינקולוגית בעולם והוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן בקרב נשים1. ניתוחים רדיקליים וכימותרפיה קשורים לשיעורי ריפוי גבוהים בשלב הראשוני. עם זאת, תוצאות הטיפול בחולות בשלב מתקדם של סרטן צוואר הרחם המפתחות מחלה גרורתית הן שליליות מאוד2. לכן, חיוני להבין עוד יותר את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס ההגירה והפלישה של תאי סרטן צוואר הרחם ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות למניעה וטיפול במחלה זו.
זיהוי גני מטרה המעורבים בהתקדמות הסרטן ומציאת דרכים לעכב את ביטוים או פעולתם מציגים אפשרויות טיפול מבטיחות. במחקר זה זיהינו את FAM83 כגן הגורם לסרטן וחקרנו עוד יותר את ההשפעות המעכבות שלו על תאי C33a ו-HeLa. אונקוגנים ממשפחת FAM83 (FAM83A-H) מדווחים באופן נרחב בסרטן אנושי 3,4. לאחרונה דווח כי FAM83A מווסת בסרטן ריאות5, שד6, שחלות7 ולבלב8, דבר המצביע על כך ש-FAM83A ממלא תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן באמצעות קידום התפשטות, פלישה, תכונות דמויות תאי גזע ועמידות לתרופות בתאי הגידול. חשוב לציין כי FAM83A זוהה כאחד הגנים המועמדים החדשים הקשורים להתקדמות נגע צוואר הרחם ולסרטן9. למרות האישור של ביטוי מוגבר של FAM83A בתאי סרטן צוואר הרחם האנושיים, ההשפעה הספציפית והמנגנונים הבסיסיים של FAM83A בסרטן צוואר הרחם עדיין אינם ברורים.
במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים המעורבים בזיהוי FAM83A כגן מטרה לגידול בסרטן צוואר הרחם ומשתמשים ב- RNA מפריע קטן (siRNA) להפלת הגן FAM83A בתאי HeLa ו – C33a . צביעת 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על התפשטות תאי הגידול, בעוד ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי סייעו להעריך נדידת תאי גידול ויכולות פלישה.
הקרישה המערבית בוצעה כדי לקבוע את רמות החלבונים הקשורים לאפופטוזיס, וצביעה של JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. לפיכך, דיווחנו כי FAM83A ממלא תפקיד קריטי בהתרבות תאים, גרורות ופלישה בסרטן צוואר הרחם. באמצעות הפרעות בתפקוד המיטוכונדריאלי הקשור למסלול PI3K/AKT ואפופטוזיס, FAM83A הפיל תאי סרטן צוואר הרחם רגישים לציספלטין (diaminedichloroplatinum, DDP). מחקר זה מספק יעד חדש לסרטן צוואר הרחם ואולי לסוגי סרטן אחרים והתייחסות לפיתוח אסטרטגיות להתגבר על עמידות תאי סרטן לתרופות כימותרפיות מסוימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
חקירת גני היעד של הגידול היא בעלת חשיבות עליונה הן למניעה והן לטיפול בסרטן צוואר הרחם. הבנת הגנים הספציפיים הממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות והתקדמות סרטן צוואר הרחם מספקת תובנה חשובה לגבי המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של המחלה. יתר על כן, זיהוי גני מטרה אלה יכול להוביל לפיתוח אסטרטגיות ט…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן לשכת המדע והטכנולוגיה של ג’ינגג’ואו (מס ‘2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
Referências
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
