Knockdown di FAM83A per verificare il suo ruolo nella crescita delle cellule tumorali cervicali e nella sensibilità al cisplatino
Summary
Qui, mostriamo le procedure per l’abbattimento di FAM83A ; i saggi per rilevare i suoi effetti sulla proliferazione, la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali del collo dell’utero; e la sensibilizzazione di queste cellule al cisplatino. Questo studio fornisce un promettente gene bersaglio per il cancro cervicale e un riferimento per ulteriori ricerche farmacologiche.
Abstract
L’esplorazione dei geni bersaglio del tumore è di fondamentale importanza per la prevenzione e il trattamento del cancro cervicale. In questo studio, delineiamo i passaggi coinvolti nell’identificazione di un gene bersaglio tumorale FAM83A nel cancro cervicale. In primo luogo, il set di dati Cancer Genome Atlas è stato utilizzato per convalidare l’espressione e il significato prognostico di FAM83A nelle donne. Un piccolo RNA interferente (siRNA) è stato utilizzato per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . Successivamente, è stata condotta la colorazione con 5-etinil-2′-desossiuridina (EdU) per determinare gli effetti sulle capacità di proliferazione delle cellule tumorali. Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento di membrane porose per valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.
Il Western blotting è stato utilizzato per quantificare i livelli proteici correlati all’apoptosi. La colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Inoltre, l’intervento di cisplatino (diamminedicloroplatino, DDP) è stato utilizzato per valutare il potenziale terapeutico del gene bersaglio. Sono stati condotti saggi di citometria a flusso e di formazione di colonie per convalidare ulteriormente le caratteristiche antitumorali del gene. Di conseguenza, è stato dimostrato che il knockdown di FAM83A inibisce la proliferazione, la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali cervicali e sensibilizza queste cellule al cisplatino. Queste metodologie complete convalidano collettivamente FAM83A come gene bersaglio associato al tumore, promettente come potenziale bersaglio terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del cancro cervicale.
Introduction
Il cancro cervicale è una preoccupazione globale in quanto è uno dei principali tipi di neoplasie ginecologiche maligne in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità correlata al cancro nelle donne1. La chirurgia radicale e la chemioradioterapia sono associate ad alti tassi di guarigione nella fase primaria. Tuttavia, i risultati del trattamento per le pazienti in fase avanzata di carcinoma cervicale che sviluppano una malattia metastatica sono molto sfavorevoli2. Pertanto, è fondamentale comprendere ulteriormente i meccanismi biologici alla base della migrazione e dell’invasione delle cellule tumorali del collo dell’utero e identificare potenziali bersagli terapeutici per la prevenzione e il trattamento di questa malattia.
L’identificazione dei geni bersaglio coinvolti nella progressione del cancro e la ricerca di modi per inibirne l’espressione o l’azione presentano opzioni terapeutiche promettenti. In questo studio, abbiamo identificato FAM83 come gene cancerogeno e abbiamo ulteriormente studiato i suoi effetti inibitori sulle cellule C33a e HeLa. Gli oncogeni della famiglia FAM83 (FAM83A-H) sono ampiamente riportati nei tumori umani 3,4. Recentemente, FAM83A è stato segnalato per essere upregolato nei tumori del polmone5, della mammella6, dell’ovaio7 e del pancreas8, indicando che FAM83A svolge un ruolo importante nella progressione del cancro attraverso la promozione della proliferazione, dell’invasione, dei tratti simili alle cellule staminali e della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali. È importante sottolineare che FAM83A è stato identificato come uno dei nuovi geni candidati associati alla progressione della lesione cervicale e alla carcinogenesi9. Nonostante la conferma di un’elevata espressione di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali umane, l’impatto specifico e i meccanismi sottostanti di FAM83A nel cancro cervicale rimangono poco chiari.
In questo studio, delineiamo i protocolli coinvolti nell’identificazione di FAM83A come gene bersaglio del tumore nel cancro cervicale e utilizziamo un piccolo RNA interferente (siRNA) per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . La colorazione con 5-etinil-2′-desossiuridina (EdU) è stata eseguita per determinare gli effetti sulla proliferazione delle cellule tumorali, mentre la guarigione delle ferite e i saggi di inserimento della membrana porosa hanno contribuito a valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.
Il Western blotting è stato eseguito per determinare i livelli di proteine correlate all’apoptosi e la colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Pertanto, abbiamo riferito che FAM83A svolge un ruolo critico nella proliferazione cellulare, nelle metastasi e nell’invasione nel cancro cervicale. Attraverso la disfunzione mitocondriale e l’apoptosi associate alla via PI3K/AKT, il knockdown di FAM83A ha sensibilizzato le cellule tumorali cervicali al cisplatino (diamminesdicloroplatino, DDP). Questo studio fornisce un nuovo bersaglio per il cancro cervicale e possibilmente altri tumori e un riferimento per lo sviluppo di strategie per superare la resistenza delle cellule tumorali a determinati farmaci chemioterapici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio dei geni bersaglio del tumore è della massima importanza sia per la prevenzione che per il trattamento del cancro cervicale. La comprensione dei geni specifici che svolgono un ruolo significativo nello sviluppo e nella progressione del cancro cervicale fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, l’identificazione di questi geni bersaglio può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e terapie mirate. In questo studio, descriviamo l’uso dell’analisi d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (n. 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
Referências
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
